实验目的：
　　粪肠球菌是常见的机会致病菌之一，广泛分布于人和动物的口腔，消化道和阴道内。定植在口腔中的粪肠球菌具有侵袭性，是牙髓根尖周病变的主要致病菌，与难治性根尖周炎密切相关。粪肠球菌有很强的生物膜形成能力，较高的常规抗生素耐受性，目前有效的治疗方案很少。本研究测定了嵌合裂解酶ClyR对浮游粪肠球菌的杀菌活性以及对其生物膜的清除能力，以探索ClyR是否能作为治疗口腔粪肠球菌相关感染性疾病的新型抗菌制剂。
　　实验方法：
　　①利用镍柱亲和层析法在原核细胞大肠杆菌BL21胞内进行诱导表达，体外纯化裂解酶ClyR；②梯度稀释平板计数法定量测定ClyR随时间和浓度变化对粪肠球菌生存率的影响；③通过酶标仪监测细菌浊度的下降来测定ClyR在不同EDTA浓度及不同 pH中的杀菌稳定性及杀菌谱；④透射电镜（TEM）切片观察ClyR的初步杀菌机制；⑤结晶紫实验和稀释平板计数法分别定性和定量测定ClyR对生物膜的降解；⑥扫描电镜和共聚焦显微镜表征ClyR清除粪肠球菌生物膜的形态和结构变化；⑦通过牙齿体外模型测定ClyR对粪肠球菌生物膜的去除效果；⑧细胞毒性实验（CCK-8）测定ClyR对牙周膜成纤维细胞的细胞毒性；实验结果：
　　①经镍柱体外纯化后，可以表达出浓度和纯度均较高的ClyR蛋白，且内毒素含量＜1EU/ml。②ClyR对粪肠球菌具有较强的快速裂解活性，且呈时间和剂量依赖性。③ClyR的酶活性质显示，即使EDTA浓度高达800μM，ClyR仍保持较高的活性；pH在5-11范围内ClyR依然有较强的杀菌活性；ClyR对粪肠球菌标准株及多株分离株有杀菌活性。④透射电镜结果显示，随着ClyR浓度的增加，细胞壁完整的细胞数与破裂细胞数之比呈下降趋势，影细胞的形成与其他文献报道的溶酶体介导的渗透细胞溶解现象相一致。⑤ClyR对粪肠球菌生物膜的降解具有高效性，且呈剂量依赖性。⑥显微结果表明ClyR通过对生物膜中细菌的直接裂解从而导致了成熟生物膜的降解。⑦在体外牙齿模型中，ClyR对生物膜的去除效果显著，在低剂量50μg/mL时对生物膜内活菌的杀灭率大于90%，明显优于氨苄西林，与临床上牙髓病治疗常用的氢氧化钙相比，具有相似的效果。⑧细胞毒性实验（CCK-8）表明，高达1000 ug/ml的ClyR与牙周膜成纤维细胞孵育24 h, 72 h后并未出现明显的细胞毒性。
　　实验结论：
　　通过检测对浮游和固着的粪肠球菌的杀菌活性表明，ClyR在治疗粪肠球菌引起的牙髓感染方面具有潜在的可能性。