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背景近年来,随着胰岛素治疗应用于临床,糖尿病急性并发症的死亡率明显减少,而糖尿病慢性并发症成为糖尿病患者致死,致残的主要原因,其中糖尿病肾病(DN)是最主要的原因之一。近年来研究发现细胞凋亡在糖尿病肾病发病中也起着重要作用,体外及体内实验,人和动物体内均证实高糖状态下肾细胞凋亡增多,但机理尚不清楚。已有许多实验和临床资料均提示糖尿病往往存在炎细胞浸润和细胞因子、炎症介质水平上升,浸润的单核／巨噬细胞通过分泌细胞因子,炎症介质及产生氧自由基等造成肾组织结构的破坏,加速肾小球硬化的进程,故炎症可能或作为上述机制的下游环节在糖尿病肾病损害的发病机制中起关键作用。NF-κB是具有多向性调节作用的蛋白质分子,能与多种细胞基因的启动子和增强子中的κB序列位点特异结合,参与基因表达的调控,在炎症、应激反应及免疫调控中起重要作用。TNF-α是由单核细胞、T淋巴细胞、肾小球系膜细胞产生的多效的多肽类细胞因子,可以通过NF-κB来诱导其表达,也可以通过自分泌和旁分泌来调节自身及其它因子的表达,对肾脏产生潜在的损害作用。两因子是否参与了糖尿病肾脏细胞凋亡作用、抑制NF-κB的活化是否可以减轻炎症反应从而减少糖尿病肾脏细胞的凋亡和坏死,尚不清楚。雷帕霉素是一种疗效好、低毒、无肾毒性的新型免疫抑制剂。近来研究表明雷帕霉素可抑制NF-κB的活化从而抑制某些细胞因子(如TNF-α等)和趋化因子的表达,从而发挥抗炎作用。但雷帕霉素抑制NF-κB的活化干预糖尿病肾脏细胞凋亡方面的作用尚未见文献报道,因此本研究拟应用公认的2型糖尿病模型来观察糖尿病肾组织肿瘤坏死因子α(TNF-α)、核因子-κB(NF-κB)的表达及其与肾组织细胞凋亡关系以及雷帕霉素的干预作用,探讨NF-κB和TNF-α促凋亡作用及雷帕霉素其可能的保护机制,从而为糖尿病肾病提供一种能有效延缓和治疗DN一个有潜力的药物。研究目的观察糖尿病肾组织肿瘤坏死因子α(TNF-α)、核因子-κB(NF-κB)的表达及其与肾组织细胞凋亡关系以及雷帕霉素对其的影响。研究方法于清醒状态下尾尖取全血,采用美国强生血糖仪在3pm时测定大鼠血糖值。以餐后(2h)血糖≥11.1mmol／L或空腹血糖(饥饿8小时)≥7.8mmol／L作为2型糖尿病的判断标准。成模后随机抽取10只GK大鼠为药物干预组,10只为糖尿病对照组,另取10只Wistar雄性大鼠作为正常对照组,即如下3组：对照组(NC组,n=10只)、雷帕霉素治疗组(DMR组,n=10只)和糖尿病组(DM组,n=10只)。实验组给予雷帕霉素6mg／Kg,一周三次。正常对照组和糖尿病组给予等剂量生理盐水,均为灌胃给药。整个实验过程中未给予胰岛素降血糖治疗。4周及8周接24小时尿,测测定24h尿白蛋白总量、尿β2-微球蛋白,处死后取血测定血糖、血甘油三酯、血总胆固醇。TUNEL法检测肾组织细胞凋亡。免疫组织化学法检测肾组织TNF-α和NF-κB的表达。研究结果1、三组间的血糖、血甘油三酯、血总胆固醇的变化情况(见表1)：DM组大鼠的血糖明显高于NC组((P<0.05),DMR组大鼠的血糖水平低于DM组(P<0.05)；DM组大鼠血TG水平明显高于NC大鼠((P<0.05),雷帕霉素对GK大鼠血TC、TG水平无影响,三组之间无统计学差异。2、各组大鼠24h尿白蛋白(ALB)及尿β2-微球蛋白(尿β2-MG)比较(见表2)：各组大鼠与正常对照组相比,ALB均增加,并具有显著性差异(P<0.05),而雷帕霉素治疗组具有明显的减少白蛋白的作用。同样,尿β2-MG在经过治疗后也有一定的减少。3、正常及糖尿病组TUNEL法检测大鼠肾组织细胞凋亡结果(见表三,图1)：正常对照组凋亡细胞很少见；4w及8w DM组大鼠肾组织细胞凋亡数逐渐增多与正常对照组比较,DM组大鼠肾脏细胞凋亡增多,且随病程延长凋亡细胞数呈增多趋势(P<0.01)。4、正常及糖尿病组NF-κBp65免疫组化结果：NF-κBp65阳性表达特征为肾脏内细胞核或胞浆内呈现棕黄色颗粒。正常各组肾小球和肾小管可见NF-κBp65少许阳性表达,主要分布在肾小管；4w DM组大鼠肾组织中NF-κBp65阳性表达增多,8w后DM组大鼠肾组织NF-κBp65明显表达,见图2。半定量分析结果显示,DM组大鼠肾组织NF-κBp65即显著增高(P<0.01),4w DM组大鼠肾组织NF-κBp65显著高于NC组及DM组(P<0.01),8w后DM组大鼠则进一步增高,显著高于DM组及4w DM组(均P<0.01),见表3。5、正常及糖尿病组TNF-α免疫组化结果：NC组大鼠肾组织TNF-α可有轻微阳性表达；4w DM组大鼠肾组织中TNF-a阳性表达增多,8w后DM组大鼠肾组织TNF-α明显表达,见图3。半定量分析结果显示,4w,8w DM组大鼠肾组织TNF-α表达有逐渐上升的趋势,均显著高于NC组(均P<0.01),见表3。6、正常及糖尿病组肾组织NF-κBp65、TNF-α的表达及与肾组织细胞凋亡之间的相关性：NF-κBp65、TNF-α阳性表达呈正相关(r=0.956,P<0.01)；NF-κBp65、TNF-α阳性表达率与病程呈正相关；肾组织TNF-a表达与肾组织细胞凋亡之间呈正相关(r=0.953,P<0.01)；肾组织NF-κBp65表达与肾组织细胞凋亡之间亦呈正相关(r=0.886,P<0.01)；见表3。7、雷帕霉素对糖尿病大鼠肾组织细胞凋亡、NF-κBp65、TNF-α表达的影响：DMR组,与DM组比较,4w、8w DMR组肾组织TNF-α和NF-κBp65的过度表达均被显著抑制(均P<0.01),4w及8w DMR组大鼠肾组织细胞凋亡数目减少。结论在本试验条件下：(1)雷帕霉素可降低2型糖尿病大鼠血糖,改善24h尿白蛋白(ALB)及尿β2-MG的排泄；糖尿病肾病发展过程中细胞数目的减少,至少部分是通过细胞凋亡机制引起；(2)NF-κB及其诱导的TNF-α在糖尿病肾病损伤中发挥重要作用；(3)雷帕霉素可能通过抑制NF-κB和TNF-α的表达减少减轻肾组织细胞凋亡。