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目的:心血管病基因治疗是目前心血管研究领域的热点,但高效安全的基因载体依然是限制其推广应用的瓶颈。与病毒类载体相比,非病毒载体在转染效率,生物相容性和安全性等方面表现出了越来越多的优势。本研究应用新型阳离子磷酸胆碱聚合物(PC polymer)作为非病毒类转基因载体,通过反义寡核苷酸(AS-ODN)技术抑制血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖,以达到通过基因治疗手段防治心血管疾病的目的。
方法:
1.应用动态光散射仪和琼脂糖凝胶电泳对不同浓度的材料溶液进行表征。
2.将MPC30-DEATo与针对c-myc基因的AS-ODN(c-myc AS-ODN)在不同条件下形成不同N/P比值的基因复合物(N/P=0,0.5,1,3和5:1),应用DNA凝胶电泳法对复合物进行表征。
3.应用MTT法检测MPC30-DEA70对HEK293细胞和VSMCs的细胞毒性。
4.将MPC30-DEA70/AS-ODN基因复合物转染至体外培养的HEK293细胞和SD大鼠胸主动脉VSMCs,应用流式细胞术检测转染效率和荧光强度。
5.激光共聚焦显微镜检测基因复合物的细胞相容性和细胞内转运机制。
6.western blot法检测VSMCs中c-myc蛋白的表达。
7.绘制VSMCs的生长曲线,观察转染c-myc AS-ODN后的细胞增殖抑制率。
结果:
1.材料MPC30-DEA70在pH=4.0-11.0范围内的0.01M PBS溶液中显示出高度的水溶性,其粒径分布性和正电呈现pH依赖性,随pH值降低粒径分布变窄而正电性增强。
2.N/P=0,0.5,1,3和5:1的MPC30-DEA70/AS-ODN基因复合物在DNA凝胶电泳中显示出不同程度的电泳迟滞,随电性增强而显著。
3.MTT法检测MPC30-DEA70在对HEK293细胞和VSMCs增殖抑制呈剂量依赖性,随着MPC30-DEA70浓度的增加,抑制效果明显,在高浓度时也显示出一定的细胞毒性。
4.流式细胞仪检测发现,在HEK293细胞和VSMCs中,复合物的转染效率和荧光强度随N/P比值增加而显著增强,与对照组相比有显著差异。
5.共聚焦显微镜观察到AS-ODN分子在细胞核内的转运,提示其有效的核定位。
6.westernblot法检测到应用MPC30-DEA70转染c-mycAS-ODN后c-myc蛋白表达的下降。
7.应用MPC30-DEA70转染c-myc AS-ODN后VSMCs的生长受到显著的抑制。
结论:新型阳离子磷酸胆碱聚合物可以有效负载和运输反义寡核苷酸,抑制血管平滑肌细胞增殖,是一种高效安全的非病毒类转基因载体。本研究为心血管疾病的基因治疗开辟了新的途径和手段。