论文部分内容阅读
盐分胁迫是全球范围内普遍存在的一种主要非生物胁迫,影响植物生长、降低农业生产力和限制区域发展。盐碱地作为国家的重要后备土地资源,其价值不容忽视,盐碱地的开发和利用对于解决我国土地资源短缺尤为重要。开发利用盐碱地最经济有效的措施就是利用耐盐碱植物本身对盐碱的抗性,所以研究盐生植物的耐盐机理具有重要的意义。虽然国内外对盐生植物的研究已经取得了一定的成果,但是对于盐生植物耐盐的分子机理还需要进行深入的研究,其中二色补血草作为典型的泌盐盐生植物,其泌盐机理还不清楚,所以本论文克隆了可能与二色补血草泌盐相关的基因并分析其功能。本试验通过从二色补血草叶片中克隆到3个囊泡运输相关基因,并对这3个基因的功能做进一步的研究:（1）对3个基因进行生物信息学分析。（2）在二色补血草中过量表达分析。（3）利用CRISPR-Cas9技术分别将二色补血草中的3个基因敲除,进一步验证该类基因的功能。（4）在拟南芥中进行过量表达分析。（5）研究拟南芥囊泡运输相关基因缺失的突变体植株。主要试验结果如下:1.根据二色补血草RNASeq的结果,我们得到了3个与二色补血草囊泡运输相关基因,分别为LB00297、LB11044和LB11277。根据这3个基因的中间序列,通过3’和5’RACE技术,获得基因的全长。LB00297基因的片段大小为1066bp,该基因编码序列为660 bp,编码219个氨基酸;LB11044基因的片段大小为1304 bp,该基因编码序列为708 bp,编码235个氨基酸;LB11277基因的片段大小为1478 bp,该基因编码序列717 bp,编码238个氨基酸。二色补血草中LB00297、LB11044和LB11277三个基因分别与拟南芥中的囊泡运输基因进行比对,同源性分别为78.94%、59.92%和67.92%。对蛋白质的理化性质进行分析,LB00297、LB11044和LB11277蛋白都是亲水蛋白,其中LB00297是稳定蛋白,LB11044和LB11277是不稳定的蛋白;将蛋白序列进行SMART分析发现,LB00297蛋白质:存在Longin区域和跨膜区域,其中Longin区域是R-SNARE区域,与拟南芥囊泡运输相关蛋白的结构一致。LB11044蛋白存在卷曲螺旋结构域和跨膜螺旋区域;LB11277蛋白:存在低复杂性区域和跨膜螺旋区域。用MEGA软件对基因进行同源序列的比对,结果发现其与菠菜和拟南芥的亲缘关系较近。2.将二色补血草中LB00297、LB11044和LB11277三个基因的CDS区域分别连接到表达载体pCAMBIA1300上,通过侵染叶片的方法侵染二色补血草,获得了二色补血草的过表株系。根据表达载体上有潮霉素抗性,因此利用其作为筛选标记,培养植株直到得到纯合体,观察盐胁迫下的表型。同时利用CRISPR-Cas9技术对基因进行靶向修饰,构建CRISPR-Cas9载体,同样利用侵染二色补血草叶片的方法,分别敲除二色补血草中LB00297、LB11044和LB11277这3个基因,得到了敲除株系。3.将二色补血草中LB00297、LB11044和LB11277三个基因的CDS区域分别连接到表达载体pCAMBIA1300上,通过花序侵染的方法获得拟南芥的过表达植株,利用潮霉素抗性筛选转基因苗,再在分子水平上验证过表达植株,最后根据孟德尔的遗传分离定律确定纯合植株,得到的纯合植株分别命名为97S-1、97S-6、44S-2、44S-5、77S-6和77S-7。我们选取LB00297对应的拟南芥基因的突变体:SALK068951.56.00.X和SALK068950.54.70.X,LB11044对应的拟南芥基因的突变体:SALK147591.51.65.X和SALK082847.19.80.n,LB11277对应的拟南芥基因的突变体:SALK119355C和SAIL121G12.v1,利用双引物法进行鉴定,获得了纯合的植株。4.盐胁迫对过表达拟南芥株系、野生型拟南芥以及突变体纯合体的影响:分别将过表达拟南芥株系、野生型拟南芥以及突变体纯合体的种子铺在不同含盐量的培养基上,观察种子萌发情况。结果表明,盐胁迫下,种子的萌发以及萌发后幼苗的生长都受到盐胁迫的抑制,并且随着盐浓度的升高,种子萌发以及萌发后幼苗根的生长都呈现下降的趋势。拟南芥过表达植株97S-1、97S-6、44S-2、44S-5、77S-6和77S-7种子的萌发较快较整齐,其萌发势以及萌发率明显高于野生型和突变体,并且77S-6和77S-7的表型更明显;在盐胁迫下,过表植株幼苗根的长度明显高于突变体植株,和野生型植株相比差异不显著。初步判断过表植株的耐盐性高于野生型,而缺少囊泡运输相关基因的拟南芥突变植株的耐盐性低于野生型植株。