论文部分内容阅读
细胞壁参与细胞的生殖、生长、分化、识别和防御等一系列过程。细胞壁的韧性结构能使细胞维持一定的形状,为植物体提供机械支持。一些细胞壁特化结构成为植物的天然保护组织和输导组织,无论对植物细胞还是植物体的生命活动都同样重要。纤维素作为细胞壁的主要成分,其含量和沉积直接影响着细胞壁的功能,许多脆性突变体都与纤维素的异常有关。研究表明,植物CesM(cellulose synthase catalytic subunit)基因编码纤维素合成酶,是纤维素合成过程中一个至关重要的元件,CesA蛋白不仅影响初生壁的合成,而且对次生壁的生物合成起着重要作用。在水稻中,脆性基因BC6(B ittleCulm)、BC7、BC11和BC13都编码植物纤维素合酶催化亚基(CesA),影响次生细胞壁中纤维素的合成,而OsCesA4,OsCesA7和OsCesA9是次生壁合成的必要基因。水稻是研究细胞壁沉淀机理的理想材料。本研究利用图位克隆、分子克隆、转基因等现代遗传和分子生物学技术从水稻武运粳7的EMS突变体bc88中分离和克隆到OsBC88基因,该基因编码一个纤维素合酶催化亚基OsCesA9。通过农杆菌介导法将OsBC88融合表达载体导入水稻日本晴(Oryza sativa L.Nipponbare)中,并作了 OsBC88的表达分析。取得以下研究结果:(1)遗传分析表明,bc88突变体性状由单隐性核基因所控制。利用Osbc88的F2遗传分离群体和经典的图位克隆技术,分离并克隆到OsBC88突变基因,并发现其突变由单碱基替换(CCG→CTG)引起,进而引起氨基酸序列的改变(Pro→Leu)。(2)表达载体构建:将OsBC88基因的调控序列与报告基因GUS的序列融合,构建成OsBC88组织特异性表达载体;将OsBC88的编码序列与报告基因GFP的序列融合,构建成OsBC88亚细胞定位表达载体。(3)利用根瘤农杆菌介导法和水稻成熟胚的诱导转化法,将上述2个表达载体成功导入水稻日本晴中,获得相应的转基因阳性植株。(4)利用GUS染色、石蜡切片、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和激光共聚焦显微镜扫描观察来分析OsBC88基因在相应的转基因阳性植株中的表达情况。结果表明,OsBC88在根、茎、叶、鞘、花中均有表达,其中在茎和根中表达量较高,这可能为Osbc88的半矮表型提供了证据,即OsBC88突变后影响了根部的正常发育及功能,进而影响地上部分的生长。将OsBC88与GFP的融合表达载体转入水稻和烟草表皮细胞中,发现OsBC88/OsCesA9定位于质膜上。质膜是纤维素合成的主要场所,这充分说明了 OsCesA9是水稻次生细胞壁中纤维素合成必不可少的纤维素合酶催化亚基之一。本研究结果为进一步研究OsBC88在纤维素合成和细胞壁形成中的分子作用机理提供遗传学和细胞学证据,为培育抗倒伏或脆嫩性状的理想育种材料提供一些理论基础。