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第一部分 循环肿瘤细胞在非小细胞肺癌预后及疗效评估中意义1.目的非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer,NSCLC)缺乏实时、有效的生物标志物评估预后及预测疗效。本研究探讨在进展期NSCLC中,循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs)是否可以预测远处转移的高风险、评估预后及早期预测治疗效果。2.方法建立单中心前瞻性观察性研究,选择初始治疗的进展期NSCLC(Ⅲ期或者Ⅳ期)患者,分别在治疗前及2周期化疗后采集外周血进行CTCs的检测。CTCs通过Cell Search检测技术进行检测。人口统计学信息、总生存期(overall survival,OS)、无进展生存期(progression free survival,PFS)等临床资料需进行随访、登记。最终统计CTCs的数量与NSCLC肿瘤标志物、组织学、远处转移情况、分期、疗效等临床特征、预后及疗效之间的关系。3.结果通过多重线性回归分析显示癌胚抗原(Carcino-embryonic antigen,CEA)和转移器官个数与CTC数量呈正相关关系(P<0.05)。基线CTC<2组的中位总生存期(overall survival,OS)是11.2个月(95%置信区间:10.37-12.03个月),明显长于CTC≥2组的8.3个月(95%置信区间:7.72-8.88个月,log-rank test P<0.05)。相类似的结果,基线CTC<2组的中位无进展生存期(progression free survival,PFS)是6.2个月(95%置信区间:5.59-6.82个月),也显著长于CTC≥2组的4.3个月(95%置信区间:3.7-4.9个月,log-rank test P<0.05)。通过配对样本T检验,对于疾病控制组(稳定、部分缓解及完全缓解)化疗前后比较CTC值无显著差异(t=1.455,P=0.15),对于疾病进展组也呈现相同的结果(t=-0.99,P=0.34)。但是,无论是基线水平还是化疗后,疾病进展组的CTC值均高于疾病控制组(P<0.05)。4.结论CTC值与CEA及转移器官数目呈正相关,同时CTC是远处转移及不良预后的预测因子,本研究中,CTC值与疗效的关系较小,然而鉴于本研究样本量有限,CTC是否与疗效相关还有待进一步证实。第二部分 上皮间质转化表型循环肿瘤细胞检测方法的构建及其在进展期非小细胞肺癌中的应用1.目的循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs)已逐渐成为非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer,NSCLC)转移监测、预后、疗效评估的“实时肿瘤液态活检”标志物。但由于在肿瘤发生发展过程中存在着上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT),导致肿瘤细胞的某些上皮标志物丢失,因而目前广泛应用的以上皮细胞标志物为靶点的检测方法存在明显缺陷。而EMT被认为是肺癌的侵袭转移的关键机制之一,因此对NSCLC间质型CTCs的检测及分析具有巨大的临床价值。故本研究拟明确NSCLC的各种亚型及相对应的分子标记物,以进一步补充和完善现有基于上皮标志物的CTCs检测方法。探讨各型CTCs与患者临床病理特征及预后之间的关系,为CTCs成为NSCLC转移预测和预后评估的生物替代标志物提供实验依据。2.方法采用不依赖Ep CAM的阴性富集(白细胞特异抗原CD45)联合细胞免疫化学方法(immunocytochemistry,ICC)构建CTCs上皮型及EMT表型的检测体系。按梯度将25、50、100和200个培养的A549细胞分别加入到5ml健康志愿者的外周血中,并通过检测加入健康者外周血A549细胞回收情况,验证该检测技术在NSCLC外周血CTCs检测中的检验效率。应用建立的CTCs上皮表型及EMT表型检测方法检测进展期NSCLC患者不同时间节点上皮型、间质型及混合型等不同表型CTCs表达情况,对上述NSCLC患者进行定期随访,登记人口统计学信息、总生存期(overall survival,OS)、无进展生存期(progression free survival,PFS)等临床资料。最终统计CTCs的数量及各亚型分布特点与NSCLC组织学、远处转移情况、分期等临床特征及预后之间的关系。3.结果(1)健康志愿者外周血加入的A549细胞与回收细胞间呈为线性相关关系(R2=0.998,P<0.001),平均检测率达75%以上(76.4%~78.1%);(2)本研究有效入组患者43例,CTCs检出率为88.37%,其中上皮型68个(25%)、间质型105个(39%)、混合型98个(36%),细胞分布以间质型为主,单因素方差分析提示上皮型CTCs均值显著低于间质型和混合型CTCs(P<0.05);(3)不同性别、吸烟状态、组织学类型以及肿瘤大小与总CTCs检出率无关(P>0.05),且各组内均值比较无显著差异(P>0.05)。淋巴结转移水平高者总CTC检出率显著高于淋巴结转移水平低者(P<0.05)。Ⅳ期患者总CTC均值显著高于Ⅲ期(P<0.05);男性与女性两组患者上皮型CTC、间质型CTC以及混合型CTC均值均无显著差异(P>0.05),在男性患者中,上皮型CTC均值低于间质型(P=0.017),也显著低于混合型CTC(P=0.02),而女性患者则未呈现此种差异;单因素方差分析结果显示,各组织类型NSCLC比较上皮型CTCs值,其均值两两比较无显著差异(P>0.05),间质型CTC及混合型CTC也呈现类似的结果;一元线性回归分析统计各型CTCs与肿瘤大小、淋巴结及远处转移之间的关系,结果显示肿瘤大小与总CTC、间质型CTC及混合型CTC数值均无线性相关关系(P>0.05)。淋巴结转移与总CTC、上皮型及间质型CTC数值之间呈现正相关关系(P<0.05,β>0)。远处转移器官数目与总CTC、间质型及混合型CTC数值呈现正相关关系(P<0.05,β>0),但与上皮型CTC无线性相关关系;独立样本T检验分析得出,Ⅳ期患者总CTC、间质型及混合型CTC均值均显著高于Ⅲ期患者;Cox比例风险回归模型得出,总CTCs是PFS的独立预测因子(HR 1.56,95%置信区间为1.06至2.30,P<0.05),同时对于预测OS也有显著意义(HR为2.79,95%置信区间为1.61至4.85,P<0.05),各种亚型CTCs中,仅间质型CTCs是OS的独立预测因子(HR为2.37,95%置信区间为1.27至4.42,P<0.05)。转移器官数目是既是PFS的独立预测因子(HR 5.83,95%置信区间为1.54至22.07,P<0.05),同时对于预测OS也具有显著意义(HR为94.65,95%置信区间为2.79至3208.02,P<0.05)。4.结论(1)不依赖Ep CAM的阴性富集(白细胞特异抗原CD45)联合ICC法构建CTCs上皮型及EMT表型的检测体系对于检测CTCs具有较高的检测效率;(2)在总检出的CTCs中细胞分布存在差异,其中以间质型为主,且上皮型CTCs均值显著低于间质型和混合型CTCs;(3)CTCs与年龄、性别、组织学类型、肿瘤大小无显著相关性,但男性患者以间质型CTCs为主,CTCs(尤其是间质型)与淋巴结转移、转移器官数目及TNM分期相关;(4)CTCs(尤其是间质型)是OS及PFS的独立预测因子;(5)发生EMT的CTCs在NSCLC的评估远处转移、预后中发挥着重要作用。