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研究目的在“干细胞具先天之精的属性,是先天之精在细胞层次的存在形式”、“精血同源”等理论的指导下,本研究运用补精生血法、补精滋阴法、补精壮阳法、补气化髓生血法来探讨补肾益精法对骨髓间充质干细胞(MSCs)增殖的影响。把中医药与干细胞研究相结合,为体外培养、扩增MSCs提供新的思路,为中医药干预临床干细胞移植治疗疾病提供有力的实验依据。在药物筛选的基础上,观察对MSCs增殖确有促进作用的中药单体、有效成分及含药血清对细胞因子表达的影响,分析它们可能的作用途径,为阐释其促进MSCs增殖的作用机理提供实验依据,将补肾益精法对MSCs增殖影响的研究深入到分子水平,也为“精”的干细胞学说提供了更充分的科学依据。研究方法1.运用全骨髓贴壁法分离、培养MSCs;通过形态学、流式细胞仪检测表面标志物鉴定MSCs。2.运用MTT法筛选对MSCs增殖具有促进作用的益精中药的单体、有效成分及含药血清,并研究其最佳促增殖时间、浓度。3.用黄芪多糖(APS)及其含药血清、二苯乙烯苷(THSG)及何首乌含药血清诱导培养MSCs 72h后,RT-PCR检测不同细胞因子mRNA表达；Real-time PCR检测SCF mRNA表达；western blot检测SCF蛋白表达；ELISA法检测培养上清液SCF含量。4.用黄精含药血清诱导培养MSCs 72h后,RT-PCR检测不同细胞因子mRNA表达：Real-time PCR检测G-CSF mRNA表达；western blot检测G-CSF蛋白表达。5.用菟丝子含药血清诱导培养MSCs 72h后,RT-PCR检测不同细胞因子mRNA表达；Real-time PCR检测BMP-2 mRNA表达；western blot检测BMP-2蛋白表达。6.用巴戟天多糖诱导培养MSCs 72h后,RT-PCR检测不同细胞因子mRNA表达；Real-time PCR检测LIF. GM-CSF mRNA表达：western blot检测LIF、GM-CSF蛋白表达。7.用3月龄SD雌性大鼠双侧卵巢切除增龄3月法复制肾虚模型；选用补肾益精代表方左归丸对模型大鼠灌胃。8.观察证常组、模型组、左归丸组大鼠MSCs细胞形态、细胞表面标志物测定、生长曲线、β-半乳糖苷酶衰老细胞染色结果,比较各组大鼠MSCs增殖能力。运用RT-PCR检测正常组、模型组、左归丸组MSCs增殖过程中不同细胞因子mRNA表达。9.通过观察正常组、模型组、左归丸组大鼠MSCs在成骨细胞分化过程中ALP活性的表达、ALP染色阳性细胞率,比较各组大鼠MSCs的成骨细胞分化能力。10.通过观察正常组、模型组、左归丸组大鼠MSCs在成脂细胞分化过程中TG的表达、油红O染色阳性细胞率,比较各组大鼠MSCs的成脂细胞分化能力。结果1.建立了比较成熟的SD大鼠MSCs的分离、纯化、扩增技术平台,免疫荧光染色法和流式细胞仪检测大鼠MSCs表面标志抗原CD44、CD29表达阳性,CD45、CD34表达阴性。2.10-1mol/L THSG、10%何首乌含药血清诱导培养MSCs72h后,可促进MSCs增殖,在此过程中,均明显促进细胞SCF mRNA表达,与空白组、空白血清组相比有显著性差异。10mol/LTHSG明显促进膜结合型与可溶性两种SCF蛋白表达,10%何首乌含药血清明显促进可溶性SCF蛋白的分泌,与空白组、空白血清组相比有显著性差异。3.10%黄精含药血清诱导培养MSCs 72h后,可促进MSCs增殖,在此过程中,明显促进细胞G-CSF mRNA及G-CSF蛋白表达,与空白血清组相比有显著性差异。4. lmg/mL巴戟天多糖、10%菟丝子含药血清诱导培养MSCs 72h后,可促进MSCs增殖。在此过程中,lmg/mL巴戟天多糖明显促进细胞LIF、GM-CSF mRNA及LIF蛋白表达,10%菟丝子含药血清明显促进细胞BMP-2 mRNA表达,与空白组、空白血清组相比有显著性差异。5. lmg/mL APS、10%APS含药血清诱导培养MSCs 72h后,可促进MSCs增殖,在此过程中,均明显促进细胞SCF mRNA表达,与空白组、空白血清组相比有显著性差异。lmg/mL APS明显促进膜结合型与可溶性两种SCF蛋白表达,10%APS含药血清明显促进可溶性SCF蛋白的分泌,与空白组、空白血清组相比有显著性差异。6.正常组、模型组、左归丸组大鼠MSCs表面标志物测定的结果显示,单位体积内的原代骨髓单个核细胞中,模型组CD34阴性细胞比率明显高于正常组,有显著性差异：且CD105阳性细胞比率有低于正常组的趋势。从P3、P5代MSCs生长曲线图均可发现,模型组大鼠MSCs增殖能力较正常组、左归丸组明显降低,有显著性差异。β-半乳糖苷酶染色结果显示,模型组衰老细胞阳性率最高,明显高于正常组,有显著性差异。7.与正常组相比,模型组MSCs在增殖过程中,GM-CSF、LIF、CSF、BMP-2 mRNA表达明显降低,有显著性差异。8.骨向诱导18、21d时,模型组、左归丸组MSCs ALP表达量明显低于正常组,有显著性差异。14d开始,模型组、左归丸组大鼠MSCs的ALP染色阳性率明显低于正常组,有统计学意义。脂向诱导14d开始,模型组、左归丸组大鼠MSCs的脂肪细胞阳性率明显高于正常组,有显著性差异。结论1.采用全骨髓贴壁法可获得稳定、均质性良好的大鼠MSCs。2.10-1mol/L THSG可促进MSCs增殖,可能与其促进细胞SCF mRNA、膜结合型与可溶性两种SCF蛋白表达有关。10%何首乌含药血清可促进MSCs增殖,可能与其促进细胞SCF mRNA及可溶性SCF蛋白表达有关。3.10%黄精含药血清促进MSCs增殖的作用,可能与其促进细胞G-CSF mRNA及G-CSF蛋白表达有关。4.10%菟丝子含药血清促进MSCs增殖的作用,可能与其促进细胞BMP-2 mRNA表达有关。lmg/mL巴戟天多糖促进MSCs增殖的作用,可能与其促进细胞LIF、GM-CSF mRNA及LIF蛋白表达有关。5. lmg/mL APS可促进MSCs增殖,可能与其促进细胞SCF mRNA、膜结合型与可溶性两种SCF蛋白表达有关。10%APS含药血清可促进MSCs增殖,可能与其促进细胞SCFmRNA及可溶性SCF蛋白表达有关。6.去卵巢大鼠MSCs增殖能力减弱,可能与其表达GM-CSF、LIF、CSF、BMP-2 mRNA表达减少有关。补肾益精代表方左归丸对肾虚大鼠MSCs增殖能力的改善有一定的作用。7.去卵巢大鼠MSCs骨向分化能力降低,脂向分化能力增强。