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【目的】
以自主合成的短肽RADA32同步负载蜂毒肽(melittin)、肿瘤细胞裂解液(tumer lysis )及免疫激活剂CpG构建新型杂交纳米疫苗MCL(Melittin-RADA32-CpG-Lysis)，在体内外观察其对黑色素瘤的治疗及预防效应，并初步探讨纳米疫苗MCL的可能效应机制。
【方法】
(一)制备新型自组装杂交纳米疫苗MCL(Melittin-RADA32-CpG-Lysis)并探讨其安全性
将自主合成的新型多肽MR(Melittin-RADA32)粉末及肿瘤细胞裂解液溶于生理盐水中，并加入免疫激活剂CpG，形成新型杂纳米疫苗MCL(Melittin-RADA32-CpG-Lysis)，通过溶血实验评估纳米疫苗MCL的生物相容性；动态监测注射MCL后小鼠体重及血生化指标评估MCL的安全性。
(二)观察MCL(Melittin-RADA32-CpG-Lysis)的肿瘤防治功效
1．经尾根部及足垫和经瘤旁多点注射给药观察疫苗MCL的治疗功效：C57BL/6小鼠皮下接种黑色素瘤B16-Luc细胞，当瘤体体积达20mm3时于尾根部及足垫部位或者瘤旁分别注射MCL(Melittin-RADA32-CpG-Lysis )、CL(CpG-Lysis)、MR(Melittin-RADA32)及PBS，通过动态监测小鼠瘤体体积及记录各组小鼠死亡时间分别计算各组抑瘤率及生存率，并绘制瘤体生长曲线及生存曲线，同时进行小动物活体成像分析小鼠活体荧光强度以评估各组药物抗癌功效。
2．提前给与小鼠注射药物观察疫苗MCL的预防功效：于C57BL/6小鼠尾根部及足垫3次给予MCL(Melittin-RADA32-CpG-Lysis )、CL(CpG-Lysis)、MR(Melittin-RADA32)及PBS后再于小鼠皮下接种黑色素瘤B16-Luc细胞，通过动态监测小鼠瘤体体积及记录各组小鼠死亡时间分别计算各组抑瘤率及生存率，并绘制瘤体生长曲线及生存曲线评估MCL预防肿瘤功效。
(三)体内外实验研究MCL(Melittin-RADA32-CpG-Lysis)防治黑色素瘤的可能机制
在体外将小鼠原代树突状细胞(dendritic cell ,DC)分别与MCL、CL、MR、PBS共孵育，采用流式细胞术检测各组活化DC的比例；构建皮下移植黑色素瘤模型，分别用MCL、CL、MR、PBS治疗，肿瘤体积达1000mm3时剥离小鼠腹股沟淋巴结观察淋巴结大小；采用Opal多光谱组织成像技术检测腹股沟淋巴结中活化DC的数量；采用流式细胞术检测各组小鼠腹股沟淋巴结中活化DC的比例及肿瘤组织中CD4+T、CD8+T细胞、IFN-γ+CD8+T细胞比例。
【结果】
(一)新型自组装杂交纳米疫苗MCL(Melittin-RADA32-CpG-Lysis)的制备及安全性研究
将新型多肽MR(Melittin-RADA32)粉末、肿瘤细胞裂解液(lysis)溶于生理盐水中，加入免疫激活剂CpG，形成新型杂纳米疫苗MCL(Melittin-RADA32-CpG-Lysis)，红细胞溶血实验表明MCL在3.2μM时溶血率为0，具有良好的生物相容性；给药前后各组小鼠体重和肝肾功能(AST、ALT、BUN、Cr、UA)均无显著改变。
(二)MCL(Melittin-RADA32-CpG-Lysis)的肿瘤防治功效
1．荷瘤小鼠足垫及尾根部给药后第28天，MCL组、CL组、MR组的抑瘤率分别为：90.74%、67.57%、31.04%；接种肿瘤后第28天的生存率分别为100%、83.33%、57.14%；瘤体生长曲线显示MCL能显著抑制肿瘤生长，且抑瘤效果优于CL及MR组；小鼠生存曲线表明与CL组、MR组、PBS组相比，MCL能显著延长荷瘤小鼠生存时间。结果表明MCL能启动特异性抗肿瘤免疫应答发挥抗黑色素瘤功效。瘤旁多点注射后MCL组、CL组、MR组的抑瘤率分别为：99.91%、91.83%、50.42%；瘤体生长曲线显示MCL能显著抑制肿瘤生长，且抑瘤效果优于CL及MR组；小动物活体荧光成像显示第28天MCL组、CL组、MR组及PBS组的荧光强度值分别为：0.94±1605*105a.u、17.62±1879*105a.u、42.28±14116*105a.u、264.46±82220*105a.u。以上结果表明MCL不仅能通过直接杀伤发挥抗肿瘤功效，还能通过启动特异性免疫应答抑制肿瘤生长，延长荷瘤小鼠生存时间。
2．在肿瘤预防模型中MCL组、CL组、MR组的抑瘤率分别为：99.36%、93.86%、46.91%；MCL组、CL组、MR组在接种肿瘤后第45天的生存率分别为：87.5%、37.5%、12.5%；瘤体生长曲线显示，与CL组、MR组相比MCL能显著抑制肿瘤生长；小鼠生存曲线表明，与对照组相比MCL显著延长了荷瘤小鼠生存时间。
(三)体内外实验研究MCL(Melittin-RADA32-CpG-Lysis)的抗癌机制
体外实验中,用MCL、CL、MR、PBS分别孵育原代DC，各组活化的DC比例分别为：91.76±0.36%、76.92±6.84%、60.04±4.00%、37.78±5.57%，说明纳米疫苗MCL在体外能高效激活DC细胞从而启动免疫应答。
体内试验中,MCL、CL、MR、PBS分别处理后各组小鼠腹股沟淋巴结中活化的DC比例分别为6.98±1.32%、4.90±0.72%、3.4±0.41%、2.51±0.35%；Opal多光谱组织成像技术检测MCL组、CL组、MR组、PBS组腹股沟淋巴结中活化DC的数量分别为：997.4±271.49个、68.6±25.12个、0±0个、2±1.41个，结果表明MCL在体内也能高效激活DC从而启动免疫应答；MCL组、CL组、MR组、PBS组瘤内CD4+T比例分别为37.58±0.68%、25.96±0.32%、20.41±0.98%、17.35±1.09%，其中MCL组CD4+T约为PBS组的2倍；MCL组、CL组、MR组、PBS组瘤内CD8+T细胞比例分别为:26.52±0.42%；16.83±0.27%；15.87±0.57%；8.98±0.39%，MCL组活化的T细胞数量明显增加，说明纳米疫苗MCL较对照组能更显著激活T细胞为主的特异性抗肿瘤免疫应答；MCL组、CL组、MR组、PBS组瘤内IFN-γ+CD8+T细胞比例分别为：5.89±0.27%、3.10±0.09%、4.07±0.27%、1.92±0.07%，MCL组是PBS组的3倍，说明纳米疫苗MCL不仅增加了T细胞的数量，同时也提升了T细胞的活性，将更有利于高效发挥抗黑色素瘤功效。
【结论】
本课题组成功合成了一种可同时装载抗瘤多肽蜂毒肽、肿瘤细胞裂解液及免疫佐剂的新型杂交纳米疫苗MCL(Melittin-RADA32-CpG-Lysis)，该疫苗不仅可通过直接杀伤及免疫效应预防及治疗黑色素瘤，还具有良好的生物相容性和安全性，且制备工艺简单，具有潜在的临床转化价值。
以自主合成的短肽RADA32同步负载蜂毒肽(melittin)、肿瘤细胞裂解液(tumer lysis )及免疫激活剂CpG构建新型杂交纳米疫苗MCL(Melittin-RADA32-CpG-Lysis)，在体内外观察其对黑色素瘤的治疗及预防效应，并初步探讨纳米疫苗MCL的可能效应机制。
【方法】
(一)制备新型自组装杂交纳米疫苗MCL(Melittin-RADA32-CpG-Lysis)并探讨其安全性
将自主合成的新型多肽MR(Melittin-RADA32)粉末及肿瘤细胞裂解液溶于生理盐水中，并加入免疫激活剂CpG，形成新型杂纳米疫苗MCL(Melittin-RADA32-CpG-Lysis)，通过溶血实验评估纳米疫苗MCL的生物相容性；动态监测注射MCL后小鼠体重及血生化指标评估MCL的安全性。
(二)观察MCL(Melittin-RADA32-CpG-Lysis)的肿瘤防治功效
1．经尾根部及足垫和经瘤旁多点注射给药观察疫苗MCL的治疗功效：C57BL/6小鼠皮下接种黑色素瘤B16-Luc细胞，当瘤体体积达20mm3时于尾根部及足垫部位或者瘤旁分别注射MCL(Melittin-RADA32-CpG-Lysis )、CL(CpG-Lysis)、MR(Melittin-RADA32)及PBS，通过动态监测小鼠瘤体体积及记录各组小鼠死亡时间分别计算各组抑瘤率及生存率，并绘制瘤体生长曲线及生存曲线，同时进行小动物活体成像分析小鼠活体荧光强度以评估各组药物抗癌功效。
2．提前给与小鼠注射药物观察疫苗MCL的预防功效：于C57BL/6小鼠尾根部及足垫3次给予MCL(Melittin-RADA32-CpG-Lysis )、CL(CpG-Lysis)、MR(Melittin-RADA32)及PBS后再于小鼠皮下接种黑色素瘤B16-Luc细胞，通过动态监测小鼠瘤体体积及记录各组小鼠死亡时间分别计算各组抑瘤率及生存率，并绘制瘤体生长曲线及生存曲线评估MCL预防肿瘤功效。
(三)体内外实验研究MCL(Melittin-RADA32-CpG-Lysis)防治黑色素瘤的可能机制
在体外将小鼠原代树突状细胞(dendritic cell ,DC)分别与MCL、CL、MR、PBS共孵育，采用流式细胞术检测各组活化DC的比例；构建皮下移植黑色素瘤模型，分别用MCL、CL、MR、PBS治疗，肿瘤体积达1000mm3时剥离小鼠腹股沟淋巴结观察淋巴结大小；采用Opal多光谱组织成像技术检测腹股沟淋巴结中活化DC的数量；采用流式细胞术检测各组小鼠腹股沟淋巴结中活化DC的比例及肿瘤组织中CD4+T、CD8+T细胞、IFN-γ+CD8+T细胞比例。
【结果】
(一)新型自组装杂交纳米疫苗MCL(Melittin-RADA32-CpG-Lysis)的制备及安全性研究
将新型多肽MR(Melittin-RADA32)粉末、肿瘤细胞裂解液(lysis)溶于生理盐水中，加入免疫激活剂CpG，形成新型杂纳米疫苗MCL(Melittin-RADA32-CpG-Lysis)，红细胞溶血实验表明MCL在3.2μM时溶血率为0，具有良好的生物相容性；给药前后各组小鼠体重和肝肾功能(AST、ALT、BUN、Cr、UA)均无显著改变。
(二)MCL(Melittin-RADA32-CpG-Lysis)的肿瘤防治功效
1．荷瘤小鼠足垫及尾根部给药后第28天，MCL组、CL组、MR组的抑瘤率分别为：90.74%、67.57%、31.04%；接种肿瘤后第28天的生存率分别为100%、83.33%、57.14%；瘤体生长曲线显示MCL能显著抑制肿瘤生长，且抑瘤效果优于CL及MR组；小鼠生存曲线表明与CL组、MR组、PBS组相比，MCL能显著延长荷瘤小鼠生存时间。结果表明MCL能启动特异性抗肿瘤免疫应答发挥抗黑色素瘤功效。瘤旁多点注射后MCL组、CL组、MR组的抑瘤率分别为：99.91%、91.83%、50.42%；瘤体生长曲线显示MCL能显著抑制肿瘤生长，且抑瘤效果优于CL及MR组；小动物活体荧光成像显示第28天MCL组、CL组、MR组及PBS组的荧光强度值分别为：0.94±1605*105a.u、17.62±1879*105a.u、42.28±14116*105a.u、264.46±82220*105a.u。以上结果表明MCL不仅能通过直接杀伤发挥抗肿瘤功效，还能通过启动特异性免疫应答抑制肿瘤生长，延长荷瘤小鼠生存时间。
2．在肿瘤预防模型中MCL组、CL组、MR组的抑瘤率分别为：99.36%、93.86%、46.91%；MCL组、CL组、MR组在接种肿瘤后第45天的生存率分别为：87.5%、37.5%、12.5%；瘤体生长曲线显示，与CL组、MR组相比MCL能显著抑制肿瘤生长；小鼠生存曲线表明，与对照组相比MCL显著延长了荷瘤小鼠生存时间。
(三)体内外实验研究MCL(Melittin-RADA32-CpG-Lysis)的抗癌机制
体外实验中,用MCL、CL、MR、PBS分别孵育原代DC，各组活化的DC比例分别为：91.76±0.36%、76.92±6.84%、60.04±4.00%、37.78±5.57%，说明纳米疫苗MCL在体外能高效激活DC细胞从而启动免疫应答。
体内试验中,MCL、CL、MR、PBS分别处理后各组小鼠腹股沟淋巴结中活化的DC比例分别为6.98±1.32%、4.90±0.72%、3.4±0.41%、2.51±0.35%；Opal多光谱组织成像技术检测MCL组、CL组、MR组、PBS组腹股沟淋巴结中活化DC的数量分别为：997.4±271.49个、68.6±25.12个、0±0个、2±1.41个，结果表明MCL在体内也能高效激活DC从而启动免疫应答；MCL组、CL组、MR组、PBS组瘤内CD4+T比例分别为37.58±0.68%、25.96±0.32%、20.41±0.98%、17.35±1.09%，其中MCL组CD4+T约为PBS组的2倍；MCL组、CL组、MR组、PBS组瘤内CD8+T细胞比例分别为:26.52±0.42%；16.83±0.27%；15.87±0.57%；8.98±0.39%，MCL组活化的T细胞数量明显增加，说明纳米疫苗MCL较对照组能更显著激活T细胞为主的特异性抗肿瘤免疫应答；MCL组、CL组、MR组、PBS组瘤内IFN-γ+CD8+T细胞比例分别为：5.89±0.27%、3.10±0.09%、4.07±0.27%、1.92±0.07%，MCL组是PBS组的3倍，说明纳米疫苗MCL不仅增加了T细胞的数量，同时也提升了T细胞的活性，将更有利于高效发挥抗黑色素瘤功效。
【结论】
本课题组成功合成了一种可同时装载抗瘤多肽蜂毒肽、肿瘤细胞裂解液及免疫佐剂的新型杂交纳米疫苗MCL(Melittin-RADA32-CpG-Lysis)，该疫苗不仅可通过直接杀伤及免疫效应预防及治疗黑色素瘤，还具有良好的生物相容性和安全性，且制备工艺简单，具有潜在的临床转化价值。