肿瘤血管生成在肿瘤生长和转移中发挥重要作用，得到了大多数研究的支持。但对淋巴管生成的研究由于缺乏特异性的标记物而受到了阻碍。近来对淋巴管内皮细胞特异标记物的发现，为进一步研究淋巴管生成、调节和生物学作用提供了可能。D2-40被认为是很好的特异性淋巴管标记物。在胃癌、甲状腺癌、神经母细胞瘤等的研究中发现淋巴管生成与肿瘤的进展转移和预后有关。淋巴转移是膀胱癌重要的转移途径，有研究表明膀胱癌淋巴管生成与肿瘤浸润和转移有关，对其进一步研究可能提供治疗膀胱癌的新靶点。最近证据表明COX—2不仅促进肿瘤血管的生成，也与淋巴管生成有关。但在膀胱癌目前还没有相关的研究。 近年来，MIF和恶性肿瘤的关系受到人们的重视。MIF是一种促炎细胞因子，具有多种生物学功能。MIF具有拮抗糖皮质激素的作用，刺激其他细胞因子的分泌，在炎症和免疫反应中具有重要作用。后来的研究表明，MIF与多种肿瘤的发生和进展有关。但MIF在人膀胱癌中表达及与膀胱癌关系的研究报道很少。有研究表明MIF在试验小鼠的尿路上皮表达，并影响肿瘤的生长和血管生成。对膀胱癌细胞系的研究也表明抑制MIF可以导致肿瘤细胞增殖减少，并影响多种细胞因子的分泌。 我们对膀胱移行细胞癌中MIF和COX—2的表达进行研究，分析其与肿瘤血管、淋巴管生成和临床病理特征的关系，并进一步分析其预后意义。了解这些因子与膀胱移行细胞癌的关系，为临床治疗提供有益的信息。由于MIF与膀胱癌关系研究较少，我们的初步研究表明MIF在膀胱移行细胞癌组织中表达增高，因此我们进一步探讨siRNA脂质体转染敲除MIF基因表达对膀胱癌T24细胞生长的影响。 第一部分 MIF和COX—2在膀胱移行细胞癌组织的表达 目的：我们应用免疫组化方法研究膀胱移行细胞癌组织标本中MIF和COX2的表达，并分析其表达与临床病理特征的关系。 方法：对110例膀胱移行细胞癌病人石蜡包埋组织标本及10例正常膀胱粘膜组织标本进行MIF、COX—2表达的免疫组化研究。并进一步应用Western blot和RT—PCR法对5对膀胱癌和癌旁正常组织中MIF蛋白和mRNA的表达进行研究。免疫组化染色阳性判断标准基于染色强度和阳性细胞百分比进行评估，并分析其表达与临床病理特征的相关性。 结果： MIF和COX—2在膀胱癌组织中高表达，阳性率分别为85/110和77/110。MIF在正常膀胱粘膜中有4例表现为弱表达；MIF在膀胱移行细胞癌组织表达高，不仅在肿瘤细胞浆内表达，在41例病人同时见到细胞核内也有表达。RT—PCR和Western blot方法研究也证实在膀胱癌组织中有MIFmRNA和蛋白的表达，并且高于相应的癌旁正常组织。MIF细胞浆内表达与肿瘤分期呈负相关关系，早期膀胱癌表达高于进展期膀胱癌，与其他临床病理特征无明显的相关性。细胞核内MIF表达主要发生在低级、低期和体积小的肿瘤。COX—2主要在肿瘤细胞浆内表达，在正常膀胱粘膜组织无表达。COX—2表达与肿瘤分级和肿瘤大小呈正相关关系，随着肿瘤分级和肿瘤体积的增长而表达增高，而与肿瘤分期未见明显的相关性。另外，MIF和COX—2的表达无明显相关性。 结论：膀胱移行细胞癌组织中MIF和COX—2均呈高表达，表明两者在膀胱移行细胞癌发生、发展中发挥作用。MIF在表浅性膀胱癌高表达提示可能在膀胱癌发生的早期发挥作用。COX—2表达与膀胱癌的分化程度有关，低分化肿瘤表达增高提示与肿瘤的侵袭性行为有关。 第二部分 MIF和COX—2在膀胱移行细胞癌组织的表达与微血管淋巴管生成的关系及其临床意义 目的：我们的研究表明MIF和COX—2在膀胱癌组织中表达增高。目前研究显示在多种肿瘤中两者的表达与微血管生成有关。而最近也有报道表明COX—2表达与淋巴管表达密切相关，可能参与肿瘤相关淋巴管的生成。我们探讨MIF和COX—2在膀胱移行细胞癌组织中的表达与微血管、淋巴管表达的关系及其预后意义。 方法：110例病人中85例获得完整随访资料，并且所有组织切片包含一定瘤旁组织。对病人同一蜡块包埋组织进行连续切片，应用免疫组织化学染色方法对CD34、D2-40表达进行研究。肿瘤内淋巴管定义为存在于肿瘤组织内的淋巴管，而肿瘤旁淋巴管定义为位于肿瘤组织外但据肿瘤组织边缘500μm之内的淋巴管。低倍镜下观察选择三个微血管或淋巴管表达密度较高的区域，然后在200倍镜下进行三个视野微血管或淋巴管计数，取其平均值作为微血管密度或肿瘤内、肿瘤旁淋巴管密度。分析MIF、COX—2表达与肿瘤微血管、淋巴管表达的关系。应用kaplan—meier生存曲线分析他们与病人生存的关系，其差别应用logrank检验进行分析。应用Cox回归模型进行多因素回归分析，确定影响病人预后的独立的相关因素。 结果：85例标本中MIF表达阳性率81.2％，36例见到细胞核内表达阳性。COX—2表达阳性率68.2％。37例(43.5％)标本中观察到瘤旁淋巴管，瘤旁淋巴管密度为2.53±3.60；14例(16.5％)标本中观察到瘤内淋巴管，瘤内淋巴管密度为0.75±1.98(范围0～10.3)。因为淋巴管表达数量较少，我们将淋巴管表达作为定性变量进行分析。瘤内淋巴管表达与肿瘤分级(X2=13.136，P=0.001)、分期(X2=26.147，P<0.001)明显相关。瘤旁淋巴管表达与肿瘤分期(X2=11.305，P=0.002)呈正相关。所有标本中均见到微血管表达，平均微血管密度(MVD)为23.77±10.68(范围5～59)，MVD与肿瘤分期相关(F=13.675，p<0.001)，肌肉浸润性膀胱癌中微血管密度明显高于非肌肉浸润性膀胱癌。进一步分析表明，与Cox2阴性组相比较，Cox2表达阳性组MVD较高，差异有显著意义(t=—2.225，P=0.029)；Cox2阳性组瘤内淋巴管表达比例明显高于阴性组(P=0.032)，而与瘤旁淋巴管表达无明显的相关性。MIF细胞浆和细胞核内表达与血管和淋巴管生成无明显相关性。 Kaplan—meier分析表明MIF表达对膀胱移行细胞癌病人的疾病特异性生存和无瘤生存没有影响。COX—2阳性表达(X2=5.972，P=0.015)和瘤内淋巴管表达(X2=12.728，p<0.001)者无瘤生存时间较短。而MVD(X2=8.355，P=0.004)、瘤内(X2=23.048，P<0.001)、瘤旁淋巴管(X2=5.710，P=0.017)表达对疾病特异性生存有明显的影响。微血管密度(X2=5.999，P=0.014)、瘤内(X2=13.865，P<0.001)和瘤旁(X2=4.183，P=0.041)淋巴管表达与肿瘤进展有关。多因素分析表明COX2表达和肿瘤分期、分级和肿瘤单发或多发是膀胱移行细胞癌病人无瘤生存独立的预后因素；而MVD和瘤内、瘤旁淋巴管表达均不是疾病特异性生存的独立预后因素。 结论：1.本组膀胱移行细胞癌中MIF表达与血管、淋巴管表达无明显相关性，并且对膀胱移行细胞癌病人的预后无明显的影响。MIF表达与膀胱移行细胞癌的关系需要进一步的研究证实，可能通过其他的机制参与膀胱癌的发生。 2.膀胱移行细胞癌中COX—2表达与微血管密度和瘤内淋巴管表达密切相关，并且是病人无瘤生存独立的预后因素。微血管和淋巴管表达与病人的生存密切相关，提示COX—2可能促进膀胱癌血管及淋巴管生成，影响肿瘤的复发、进展和侵袭转移。对COX—2和肿瘤微血管、淋巴管进行研究，对临床工作中判断病人的预后和指导治疗有重要的意义。 第三部分小干扰RNA抑制MIF基因表达对膀胱癌细胞生长的影响 目的：我们的研究初步表明MIF在膀胱移行细胞癌的表达增高，早期膀胱癌表达高于进展期膀胱癌。而先前的研究表明MIF与多种肿瘤的细胞增殖和侵袭转移能力有关。为了进一步探讨MIF表达在膀胱移行细胞癌中的作用，我们研究siRNA进行MIF基因敲除对膀胱癌细胞生长的影响，并对转染前后膀胱癌细胞CyclinD1的表达进行研究。 方法：应用siRNA转染膀胱癌T24细胞，抑制MIF基因的表达。采用westernblot和RT—PCR法测定转染前后膀胱癌细胞MIF和CyclinD1蛋白、mRNA的表达，并采用MTT法分析siRNA转染抑制MIF基因表达对细胞生长的影响。 结果：应用siRNA转染膀胱癌T24细胞后，继续培养48小时进行研究发现MIFmRNA和蛋白表达减少，并且与应用的siRNA的浓度有关。应用MTT法对不同浓度siRNA对膀胱癌细胞生长的影响进行分析，各组平均吸光度A值分别为：对照组0.983±0.174；50nmol MIFsiRNA组0.669±0.033；100nmol MIFsiRNA组0.365±0.044，差异有统计学意义(F=25.530，p=0.001)。以对照组吸光度A值为基础，计算细胞增殖抑制率50nmol/L MIFsiRNA组为30.93％，100nmol/L浓度MIFsiRNA组为62.23％，两者比较差异有显著性意义(t=—5.054，p=0.007)。并且应用siRNA转染抑制MIF基因表达后，CyclinD1蛋白和mRNA的表达也减少。 结论：siRNA转染抑制了MIFmRNA的表达和蛋白的分泌，同时膀胱癌细胞的增殖受到明显的抑制。MIF可能通过调节CyclinD1表达促进细胞周期的进展，导致细胞增殖增加，凋亡减少，从而在膀胱移行细胞癌的发生和发展中发挥作用。