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猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRS virus,PRRSV)引起的一种以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸障碍为特征的急性传染病。1987年,该病在美国首次报道。2006年,中国爆发高致病性PRRS,除了经典症状以外,以高致病率与高死亡率为主要特点。PRRSV为单股正链RNA病毒,属于套式病毒目,动脉炎病毒科,动脉炎病毒属;基因组在核糖体移码框的作用下转录并翻译为pp1a与pp1ab两段多肽,并在其自身产生的水解酶的作用下,将这两条多肽链消化产生多于12种非结构蛋白,这些非结构蛋白会参与结构蛋白的合成,与此同时,产生的结构蛋白与非结构蛋白会一同协作,参与病毒感染宿主细胞的过程。PRRSV具有严格的细胞嗜性,在患猪体内病毒主要靶细胞是肺泡巨噬细胞(PAM)以及不同组织的单核巨噬细胞,不同毒力的毒株感染PAM效率有显著差异,导致这种差异的机制尚不清楚。本研究以高致病性PRRSV HuN4强毒株与其传代致弱的HuN4-F112弱毒株为参考毒株,构建重组EGFP-PRRSV强弱毒感染性克隆,感染和纯化PAM,进行定性蛋白质谱分析;同时以其亲本强弱毒感染宿主PAM细胞膜蛋白进行定量蛋白质谱分析,筛选及验证与病毒相互作用PAM细胞膜差异蛋白,可揭示PRRSV不同毒力毒株感染细胞效率差异的分子基础,为PRRSV致病机制的研究提供理论依据。为了纯化和筛选与PRRSV相互作用的宿主细胞膜蛋白,本研究首先分别构建了含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的重组PRRSV强弱毒感染性克隆,作为指示病毒,为筛选及验证与PRRSV相互作用的PAM细胞膜蛋白提供技术支撑。以PRRSV HuN4感染性克隆以及其传代致弱毒株HuN4-F112感染性克隆为骨架,利用反向遗传操作技术,在其病毒基因组ORF1b和ORF2a之间插入egfp基因,并在外源基因3?端下游插入该病毒的转录调控序列6(TRS6),构建重组病毒感染性分子克隆pHuN4-EGFP和pHuN4-F112-EGFP,并通过转染拯救出重组病毒。在MARC-145细胞中,将重组病毒连续传代,其外源egfp基因仍能够持续表达,表明该重组病毒具有良好的遗传稳定性。重组病毒在病毒滴度、噬斑形态、生长能力等方面与亲本毒无明显差异。在获得具有能够持续表达绿色荧光蛋白的重组PRRSV强弱毒之后,将强弱毒重组病毒分别感染PAM,纯化PAM,提取细胞膜蛋白进行定性蛋白质谱分析,筛选及验证与病毒相互作用PAM细胞膜差异蛋白。结果表明,在分选流式仪的FITC通道中,可获得强弱重组病毒感染PAM而产生的绿色荧光信号,分选出重组病毒感染的PAM,获得了纯化的细胞膜蛋白,利用Shotgun方法进行了膜蛋白定性蛋白质谱分析,获得的蛋白信息进行GO注释,并按蛋白分类分析,筛选出强弱毒差异蛋白93个。对选择的5个相关蛋白进行标签融合和真核上调表达试验,发现Apolipoprotein M、JUP、Apolipoprotein A-IV和Kexin type9对强毒存在抑制作用,推测为抵御PRRSV感染的宿主蛋白;Clusterin isoform x1对强毒的感染存在上调作用,推测可能是PRRSV感染的宿主受体蛋白。以其亲本强弱毒感染宿主PAM细胞膜蛋白进行了定量蛋白质谱分析,筛选及验证了与病毒相互作用PAM细胞膜差异蛋白。结果表明,通过Label-free定量蛋白质组分析,获得差异蛋白95个,其中确定定位在膜上26个;通过Western Blot验证了KDEL受体以及Histone H3蛋白,发现与质谱结果中强弱毒组检测结果一致,证明了质谱的可靠性;通过String analysis方法寻找强弱毒之间的差异感染机制,揭示了不同毒力PRRSV感染PAM的差异潜在信号通路。