天然免疫系统是抵御病原微生物感染的第一道防线,其主要由参与天然免疫的效应分子和效应细胞构成。常见的效应分子有防御素、补体系统、细胞因子和溶菌酶等；效应细胞有吞噬细胞和NK细胞等。天然免疫的识别机制是由多种识别分子及效应分子组成的复杂的网络结构,其可通过模式识别受体(pattern recognition receptor, PRR)如甘露聚糖结合凝集素(mannan-binding lectin, MBL)、肽聚糖识别蛋白、Toll样受体(Toll-like receptor, TLR)等识别病原相关分子模式(pathogen associated molecular pattern, PAMP)识别相关的病原微生物而发挥作用,参与机体的免疫调节。MBL为肝脏合成的血浆蛋白,是天然免疫补体系统中启动凝集素途径的关键蛋白。MBL是一种分泌型PRR,是C型凝集素超家族中胶凝素(collectins)家族的一员。MBL可选择性识别多种病原体表面的糖结构,可通过凝集素途径以不依赖抗体和Clq的方式激活补体,从而介导调理吞噬作用及发挥溶破和间接调理功能,并能与吞噬细胞表面胶凝素受体结合而直接介导调理吞噬作用,还能清除免疫复合物和凋亡细胞。正常人血浆中的MBL水平在40-5000μg/L之间,但是作为一种急性期反应蛋白,在应激(如病原体感染、外科手术等)时,其血浆浓度可升高2-3倍。现已发现,胶凝素家族的其他成员如肺表面活性物质相关蛋白A和D(surfactant Protein A-. surfactant protein D, SP-A、SP-D)、补体Clq等具有多种免疫调节功能,如SP-A能够抑制DC的成熟和分化；Fraser等发现MBL能够抑制脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)诱导的单核巨噬细胞分泌TNF-a等细胞因子。而目前国内外关于MBL对中性粒细胞(polymorphonuclear neutrophils, PMN)功能的影响报道较少,因此有必要深入探讨。本研究中,我们利用人PMN为细胞模型,初步研究了有无MBL缺陷人血清条件下MBL对PMN功能的影响,及在白色念珠菌刺激下对PMN功能的影响。第一章人天然MBL的提取与纯化MBL是肝细胞分泌的血浆蛋白,是天然免疫系统中一个关键的可溶性模式识别受体。正常人血浆中MBL含量较低,约10～5000μg/L,平均约为1200μg/L。基于本科室的长期工作基础,已经建立了对人天然MBL分离纯化的方法。因有文献报道热原及血浆中IgG有可能干扰实验,因此在本研究中,我们通过甘露聚糖-Sepharose4B亲和层析体系,分离得到粗提MBL,经LC柱和多粘菌素B凝胶柱去除IgG与LPS,最后得到无热源的人天然MBL蛋白。通过SDS-PAGE和Western blot检测纯化MBL的纯度及存在形式；同时应用配体结合实验鉴定MBL的活性。同时SDS-PAGE和Western blot结果显示纯化得到的MBL主要以高聚体的形式(分子量>200KD)存在,杂蛋白IgG得到明显的去除；同时鲎试剂检测表明,经过多粘菌素B凝胶柱纯化后的MBL中残余的LPS量符合无热源要求；并通过配体结合实验证实所得的MBL仍保持良好的结合活性,为后续的实验开展提供可靠的保证。第二章存在补体时MBL对人PMN功能的影响PMN作为天然免疫中重要的吞噬细胞,在抗病原微生物感染中起着重要作用。其在炎症局部促炎因子和趋化因子的作用下,可快速迁移到炎症部位并通过释放炎性细胞因子、活性氧及脱颗粒等发挥抗感染作用。PMN作为人体数量最多的吞噬细胞,在天然免疫防御中发挥着极其重要的意义；但在免疫调节紊乱的情况下,PMN可能加重炎症反应从而使机体产生严重的损害,因此对PMN功能调节的研究显得尤为重要。由于MBL也是天然免疫系统重要的效应分子,因此我们研究MBL对PMN功能的影响。我们采用ELISA和Dot blot法检测MBL与微生物的结合；以ELISA检测MBL对PMN分泌TNF-α和IL-6的影响；应用流式细胞术检测及荧光显微镜观察MBL对PMN吞噬功能的影响；qPCR分析MBL对PMN表达IL-1β,TNF-α和CDllb的影响；应用NBT法检测MBL对PMN呼吸爆发的影响。ELISA和Dot bolt结果显示MBL与微生物结合并呈浓度依赖关系；存在MBL缺陷人血清时,MBL促进PMN对白色念珠菌(Candida albicans, C. albicans)吞噬,且可被Mannan阻断,但对吞噬大肠杆菌(Escherichia coli, E. coli)无明显差别；qPCR结果显示：与空白组相比,MBL组PMN表达IL-1β, TNF-α及CDllb的水平增高；同时ELISA结果显MBL组对比空白组TNF-a和IL-6分泌增加；NBT结果显示,MBL组呼吸爆发程度高于对照组。以上结果提示MBL能促进炎性细胞因子分泌,增强PMN吞噬功能。第三章无补体存在时MBL对PMN功能的影响MBL的糖识别域(carbohydrate-recognition domain, CRD)可识别病原微生物表面的糖结构,并通过其CLR与吞噬细胞表面胶凝素受体结合,以不依赖补体系统,而发挥直接调理功能和MBL依赖的细胞介导的细胞毒作用。因此我们研究了无补体存在时MBL对PMN功能的影响。通过ELISA法检测MBL对PMN分泌TNF-a和IL-6的影响；应用qPCR检测MBL对PMN表达IL-1β,TNF-α及IL-6及相关凋亡基因mRNA的影响；采用NBT法检测MBL对PMN呼吸爆发的影响；应用hoechst检测MBL对PMN凋亡的影响。ELISA结果显示,C.albicans刺激PMN时,低剂量的MBL (2.5μg/ml)可显著促进PMN分泌TNF-α和IL-6,而较高剂量的MBL(20μg/ml)对比低剂量的MBL(2.5μg/ml), TNF-α的分泌受到显著的抑制,同时抑制作用可被Mannan所阻断；qPCR检测TNF-α和IL-6mRNA的结果也与ELISA结果相似；LPS刺激PMN时,ELISA和qPCR结果显示高浓度的MBL可抑制TNF-α的分泌；Hoechst检测结果显示高浓度MBL处理后PMN核质染色高亮点明显增多对比空白组；qPCR检测结果显示高浓度的MBL可上调Caspase-3和Fas的表达。以上结果显示在白色念珠菌存在时,MBL可能具有双重免疫功能,提示MBL对机体的炎症应答的调节起重要作用。综上所述,我们利用纯化人天然MBL研究了MBL对PMN功能的影响,结果提示MBL的作用可能受到效应细胞的状态和微环境的影响而有所不同。在无病原体条件下,MBL的作用以促炎为主；而在C. albicans(?)口LPS刺激下,MBL的作用具有双重性,低剂量促炎,而高剂量则抑制炎性因子的表达。