细胞外基质(extracellular matrix,ECM)是细胞分泌的细胞外分子,为周围细胞提供一个微环境,具有结构支持和信号转导功能,在细胞事件中起着积极关键的作用。心脏ECM的时空表达对于心脏的发育、再生和重塑至关重要。心外膜细胞和纤维母细胞是心脏ECM的主要来源,心脏ECM的组成包括透明质酸、纤维连接蛋白、骨膜蛋白、肌腱蛋白-C、胶原蛋白和蛋白多糖等。ECM通过与细胞表面受体结合,调控细胞的增殖、分化、迁移和稳态等过程。心外膜是包裹和保护心脏的特殊上皮组织,具有影响心脏发育及参与血管生成等作用。心外膜祖细胞(epicardial progenitor cells,EPCs)具有多分化潜能,在心脏内特异性表达Tbx18、Wt1、Tcf21转录因子,经上皮-间充质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)迁移到心肌,分化成冠脉血管平滑肌细胞,形成冠脉骨架结构。EPCs向平滑肌的分化过程受到ECM的调控。Agrin是一种硫酸肝素类蛋白多糖,是心脏ECM的组成成分之一,研究发现agrin主要与细胞表面受体肌营养不良聚糖(dystroglycan,DAG)和酪氨酸激酶(MuSK)结合,调控细胞增殖、迁移和分化等。最新研究发现agrin能够促进小鼠心肌细胞增殖,使成年小鼠心肌损伤后再生。而agrin对EPCs的分化和迁移作用还不清楚,明确agrin在EPCs向平滑肌细胞分化过程中的作用,对冠状动脉血管疾病具有一定的临床应用价值。因此,在本研究中我们探讨了agrin在心肌内的时空表达以及在EPCs向平滑肌细胞分化过程中的作用。第一部分:Agrin在心肌及心外膜上的时空表达目的:建立心外膜祖细胞的体外培养模型,检测agrin在心肌内的时空表达水平,为探索agrin调控心外膜祖细胞的分化奠定基础。方法:获取E11.5天胚胎小鼠心室组织进行整体培养,心外膜祖细胞从组织边缘生长出来,使用RT-PCR和免疫荧光检测心外膜祖细胞特异性标志物Tbx18和Wt1。通过Western blot、免疫荧光和RT-PCR检测不同年龄段小鼠心肌组织内agrin的表达情况。结果:培养出的细胞形态呈“铺路石”样,细胞高表达心外膜祖细胞特异性转录因子Tbx18和WT1,低表达cTnT。Agrin在小鼠心肌内平均水平从E11.5-P0逐渐升高,P0-P28逐渐降低。Agrin在小鼠心外膜及心内膜上表达较高,且Agrin在心外膜祖细胞上表达水平高于整个心肌组织平均水平。结论:培养出的原代细胞为心外膜祖细胞,我们成功建立了心外膜祖细胞体外培养模型。Agrin在小鼠心外膜及心外膜祖细胞上表达,agrin在小鼠心肌内及心外膜上表达具有动态变化特点。第二部分:Agrin与受体α-dystroglycan结合抑制心外膜祖细胞向平滑肌细胞分化目的:探讨agrin在心外膜祖细胞向平滑肌细胞分化中的作用。方法:建立体外心外膜祖细胞培养模型,用不同浓度agrin处理细胞,使用RT-PCR和免疫荧光检测平滑肌细胞标志物α-SMA和MYH11的表达,筛选出agrin药物干预的最佳刺激浓度。同时使用PCR和免疫荧光方法检测agrin在心外膜祖细胞上的受体。结果:200ng/ml浓度的agrin干预心外膜祖细胞5天,与对照组相比α-SMA及MYH11的表达量明显降低。心外膜祖细胞及小鼠心脏心外膜上存在agrin受体α-dystryglycan(DAG),而不存在肌肉特异性受体酪氨酸激酶(muscle-specific receptor tyrosine kinase,MuSK)。适宜浓度的agrin与DAG结合后能够下调心外膜祖细胞α-SMA和MYH11表达。使用DAG抗体阻断agrin与受体DAG结合,agrin对α-SMA和MYH11的抑制作用消失。结论:心外膜祖细胞上存在agrin受体DAG,适宜浓度的agrin通过与DAG结合抑制心外膜祖细胞向平滑肌细胞分化。第三部分:agrin通过Notch-1信号通路调控心外膜祖细胞向平滑肌细胞分化目的:观察agrin介导的信号通路对心外膜祖细胞向平滑肌细胞分化的影响。方法:使用RT-PCR检测agrin干预心外膜祖细胞后对Notch信号通路的影响。使用适宜浓度的Notch-1受体激动剂Jagged-1激活心外膜祖细胞Notch-1通路,观察Notch-1活化后对心外膜祖细胞分化的影响,使用RT-PCR和免疫荧光检测Notch-1信号通路因子以及平滑肌细胞标志物α-SMA和MYH11表达。在Jagged-1激活Notch-1通路条件下,同时使用agrin干预心外膜祖细胞,并检测α-SMA和MYH11表达。在激活Notch-1信号条件下,阻断agrin与DAG受体结合,观察Notch-1信号通路关键因子及平滑肌细胞标志物α-SMA和MYH11表达。在agrin和Jagged-1不同处理条件下,通过凝胶收缩实验评价细胞收缩能力,划痕实验评价细胞迁移能力。结果:agrin干预使心外膜祖细胞Notch-1,Hes-1及Heyl表达下调,使用500ng/ml浓度Jagged-1能够使Notch信号通路因子Notch-1,Hes-1,Heyl等表达上调,同时α-SMA和MYH11表达升高。在Notch-1激活条件下,使用agrin干预心外膜祖细胞,Notch-1和Hes-1表达受到抑制,α-SMA和MYH11表达下调。而阻断受体DAG后,agrin对Notch-1信号以及α-SMA和MYH11抑制作用消失。Jagged-1干预细胞后凝胶收缩能力增强,细胞迁移能力减弱;而agrin干预后凝胶收缩能力减弱,细胞迁移能力增强。结论:Agrin通过下调Notch-1信号通路抑制心外膜祖细胞向平滑肌细胞分化。Agrin具有抑制心外膜祖细胞分化,促进其迁移作用。