背景与目的肝细胞癌英文名称Hepatocellular Carcinoma缩写HCC,我们通常简称肝癌。肝癌是现在世界上致死率最高的恶性肿瘤之一,并且在全世界范围内的发病率有逐年升高的趋势。我国死于肝癌者占全球肝癌死亡人数的53%。它给人们造成了极大的痛苦和困扰,当看到患者因为诊断延误,肝癌晚期的时候我们感到非常的痛心,非常的无奈,也多了份作为医护人员的惋惜。当前我们对晚期肝癌的治疗还不够理想,因此早期诊断对肝癌患者的预后至关重要。AFP是检查肝癌常见的主要方法,当AFP出现异常增高时,就要考虑肝癌或其他严重肝病的可能。临床发现有60%~75%的肝癌患者血清甲胎蛋白是升高的,这些患者的血清甲胎蛋白平均值在490 ng/ml以上,但是也有15%~25%的肝癌患者血清甲胎蛋白正常。这种差异性能不能达到我们的理想效果呢,事实上并非我们想的那么好,因为除肝癌外许多疾病都可能引起血清甲胎蛋白增高,现在已知的疾病有胆管细胞癌,卵黄囊肿瘤,肝硬化,原发性胃癌,病毒性肝炎,宫内死胎,胎儿严重神经管畸形,新生儿肝炎等,甚至是正常人也可能出现甲胎蛋白升高。所以单单依靠检测患者血清甲胎蛋白作为依据来判断患者是否肝癌还不够严谨,从而筛选新的肝癌标记物受到了高度关注。我们综合现代医学研究的成果,和肿瘤有很大关系的RecQ解旋酶家族进入了我们的研究视线。RecQL4(人解螺旋酶蛋白,DNA helicase Q1-like)是RecQ解旋酶家族其中之一,在维持基因组稳定性方面起着非常重要的作用。RecQL4广泛的参与DNA的复制和损伤的修复,RecQL4的缺失可导致个体发育不全,也能导致早衰,肿瘤的几率更高。许多实验研究中发现它在肝癌时增高,这引起了医护人员的高度关注,但是相关的临床研究较少,本研究旨在探讨RECQL4在肝癌诊断中的价值。材料和方法1材料采集50例肝癌,40例肝硬化,20例食管癌,20例乳腺癌,20例胃癌及20例健康志愿者的外周静脉血5ml于EDTA-抗凝管内,在常温下以3500r/min离心15分钟,取上清进行分装,并放置在-80℃下冷冻保存待用。并详细记录肝癌患者完整的临床资料,包括性别、年龄、肿瘤大小及肿瘤TNM分期等。病人均为我院消化科和肝胆外科住院患者,且已签署知情同意书,经医院伦理委员会批准。2方法应用RecQL4 ELISA试剂盒及AFP ELISA试剂盒(Novatein Bio公司),按说明书操作。用96孔酶标仪于波长450nm测OD值,用ELISA Calc采用Logistic曲线拟合(四参数)法计算标准曲线回归方程,分别计算出蛋白质浓度。按美国Invitrogen公司提供的Trizol试剂说明书操作,提取血浆总RNA。放在严格的储存环境下进行储存,以备后用。用紫外分光光度计测定所提取的DNA的A260/A280,然后计算总RNA的纯度。引物设计由上海生物工程有限公司设计并合成吗,上海生物工程有限公司提供GAPDH作为内参基因,按大连宝生物公司提供的说明书进行操作,先后进行去除基因组DNA反应和逆转录反应。荧光定量PCR按照大连宝生物公司提供的SYBR Premix Ex TaqⅡ试剂盒说明书进行操作。用美国产ABI 7300扩增仪进行PCR反应,反应条件为95℃预变性30s,进入PCR反应:95℃5S,60℃31S,共40个循环。记录各样本Ct值,每个样本测三次取平均值,。结果1.小肝癌患者中,RECQL4mRNA阳性率为77.78%,,显著高于肝硬化,乳腺癌,胃癌,食管癌及健康志愿者中RECQL4mRNA的表达(P<0.01)。在小肝癌患者中RECQL4的蛋白质浓度平均水平为20.18ng/m L,仍明显高于肝硬化(10.24 ng/m L)及健康志愿者(2.17 ng/m L)的平均水平(P<0.01)。2.在肝癌患者中,RECQL4蛋白质水平升高与肿瘤TNM分期Ⅲ-Ⅳ期、血管浸润、淋巴结转移正相关(P<0.05)。3.血浆中RECQL4 mRNA阳性表达率与其蛋白质浓度呈正相关(r=0.481,χ2=13.241,P<0.01)。4.RECQL4 mRNA与AFP的相关性。RECQL4蛋白质在肝癌患者血浆中的平均值为22.43ng/m L,显著高于肝硬化患者10.24 ng/m L及健康志愿者2.17ng/m L(P<0.01)。在肝癌患者血浆中,RECQL4 mRNA阳性表达率及蛋白质浓度与血浆AFP蛋白水平无显著相关性(P>0.05)。5.在AFP阴性的小肝癌实验对象中,RECQL4mRNA阳性率明显高于肝硬化,乳腺癌,胃癌,食管癌及健康志愿者中的表达(P<0.01)。6.RECQL4 mRNA与AFP的联合诊断的医学价值。RECQL4 mRNA与AFP的联合诊断中只要有一项显示阳性即联合诊断为阳性.在小肝癌中,阳性敏感度61.11%提升至88.89%。在AFP阴性肝癌患者中,联合使用RECQL4mRNA,RECQL4蛋白质及AFP可将敏感度由仅使用AFP时的72%提升至90%。讨论和结论基因是带有遗传讯息的DNA片段,基因操纵着生命体的细胞分裂,细胞增殖,和蛋白质合成等重要过程。基因承载着人的生、长、衰、病、老、死的重要信息。基因在整个周期内是影响生命健康的内在因素。人类疾病与基因组的稳定性密切相关,基因的稳定性包括了DNA复制、修复、端粒维持及线粒体稳定等多个环节和时期。鉴于基因在生命健康的重要作用,我们对肝癌患者血浆RECQL4变化进行的深入研究和分析。RecQL4是RecQ解旋酶家族其中之一,在维持基因组稳定性方面起着非常重要的作用。RecQL4广泛的参与DNA的复制和损伤的修复。RECQ解旋酶家族由RECQL1、RECQL2、RECQL3、RECQL4和RECQL5z这五个成员组成,目前RECQL1和RECQL5还没有发现和疾病有什么关联。但是,研究发现RECQL2、RECQL3和RECQL4的变异会导致一系列基因组异常,并且这一基因组的异常又与某些疾病紧密相关。研究发现RECQL4至少与3种基因组紊乱疾病有非常大的关联。这3种基因组紊乱疾病RTS、RAPA和BGS,其中RTS患者和BGS患者都有很高的患发骨肉瘤和淋巴瘤的倾向。RECQL4还可通过控制维持线粒体和端粒的基因稳定性来避免多种肿瘤发生,临床研究发现血液恶性肿瘤爆发很可能与RECQL4相关,而且这些患者的症状不尽相同。遵循着前辈的研究成果,我们本着一颗严谨的心,科学的态度,在征得标本对象同意的情况下我们采集了50例肝癌,40例肝硬化,20例食管癌,20例乳腺癌,20例胃癌及20例健康志愿者的外周静脉血进行研究。研究发现,肝细胞肝癌患者血浆中RECQL4 mRNA表达水平与肝硬化患者以及健康志愿者相比,肝细胞肝癌患者血浆中RECQL4 mRNA及蛋白质呈高表达,且具有统计学意义,所以它们作为肝细胞肝癌的无创性诊断标志物是有医学价值的。研究发现,血浆中RECQL4 mRNA阳性表达率与RECQL4蛋白质浓度呈正相关。在肝癌患者中,RECQL4蛋白质水平与血管浸润、淋巴结转移、肿瘤TNM分期Ⅲ-Ⅳ期是正相关的。AFP阴性肝细胞肝癌患者及小肝癌患者中,RECQL4mRNA阳性率和蛋白质浓度显著高于肝硬化,乳腺癌,胃癌,食管癌及健康志愿者。血浆RECQL4 mRNA及蛋白质的差异性在AFP阴性肝癌及小肝癌中均有较高的敏感度,这一切都在提示它们在早期肝癌诊断时具有特殊的价值。通过对RECQL4 mRNA及蛋白质在血浆中的表达关联性分析,显示RECQL4mRNA及蛋白质在人类血浆中的表达和AFP在人类血浆中的表达具有相对独立性,且联合RECQL4 mRNA,蛋白质及AFP诊断可大幅提高敏感度,提高肝癌的诊断率.综上所述:血浆中RECQL4基因表达在肝癌诊断中的具有重要的应用价值.特别是和AFP的联合诊断早期肝癌具有重要的医学临床价值,值得我们深入研究.