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肝脏分泌的铁调素是机体系统铁代谢的中枢调节因子,在炎症状态下表达上调可引起血铁过少和贫血,阐明炎症状态下铁调素表达上调的机制有助于炎症性贫血的治疗。小鼠炎性肠炎(Inflammatory Bowel Disease,IBD)模型的研究结果表明,结肠炎引起的铁调素表达上调与肠道共生菌菌群组成相关。因此,本论文选用婴儿典型肠道共生菌Bifidobacterium infantis和成人典型肠道共生菌Bacteroidesfragilis,研究肠道共生菌对肝细胞铁调素表达的影响及其相关机制,为临床治疗炎症性贫血提供新理论支持。1 B.infantis和Bfragilis对肝细胞铁调素表达的影响及其机制试验采用厌氧培养于MRS(dMan Rogosa Sharpe)的B.infantis和RCM(Reinforced Clostridial Medium)B.fragilis,或 3 种 TLR(Toll-like Receptor)配体(LPS、Pam3Cys和Flagellin)分别接种或刺激人肝细胞系的HuH7细胞,通过qRT-PCR方法检测HuH7细胞铁调素mRNA表达水平的变化。qRT-PCR结果表明,B,infantis和Bfragilis接种HuH7细胞或TLR配体的刺激不影响HuH7细胞铁调素mRNA的表达。试验采用厌氧培养的B.infantis和Bfragilis接种THP-1巨噬细胞,收集接种后的THP-1巨噬细胞上清液,继而刺激HuH7细胞,通过qRT-PCR方法检测HuH7细胞铁调素mRNA表达的变化。结果表明,B.infantis和B.fragilis接种THP-1巨噬细胞后的细胞上清液均可显著上调HuH7细胞铁调素mRNA表达水平。通过ELISA对B.infantis和B.fragilis接种THP-1巨噬细胞后的细胞上清液中的成分进行检测后发现,B.infantis和B.fragilis均可显著增加细胞上清液中的IL-1β含量,当在HuH7细胞中加入Anti-IL-1β抗体后,B.infantis和B.fragilis接种THP-1巨噬细胞后的细胞上清液上调HuH7细胞铁调素mRNA表达的作用显著降低。纯化的重组IL-1β刺激HuH7细胞和人原代肝细胞或给小鼠腹腔注射后,通过qRT-PCR检测HuH7细胞和人原代肝细胞或小鼠肝脏铁调素mRNA表达水平可知,重组IL-1β可显著上调HuH7细胞、人原代肝细胞和小鼠肝脏铁调素mRNA表达水平,并且显著降低小鼠血清中的铁含量。以上结果表明,IL-1β是引起肝细胞和肝脏铁调素表达上调的效应分子。为进一步探讨机理,对IL-1β改变HuH7细胞和小鼠肝脏中与铁调素表达的相关蛋白进行了 Western Blot检测。结果表明,IL-1β显著增加HuH7细胞和小鼠肝脏中SMAD1/5/8(Small Mothers Against Decapentaplegic 1/5/8)蛋白的磷酸化,而 Anti-IL-1β抗体显著抑制磷酸化。qRT-PCR对激活BMP(Bone Morphogenetic Protein)信号通路的相关分子检测的结果表明,IL-1β通过BMP2激活人肝细胞的BMP信号通路,而通过Activin B激活小鼠肝脏的BMP信号通路。BMP信号通路抑制剂Dorsomorphin或LDN193189均可抑制IL-1β对HuH7细胞铁调素mRNA表达的上调作用,Anti-BMP2抗体也可显著抑制IL-1β对HuH7细胞和人原代肝细胞铁调素mRNA表达的上调作用。2 B.infantis和B.fragilis引起巨噬细胞分泌IL-1β的机制试验采用厌氧培养的B.infantis和B.fragilis接种小鼠骨髓来源巨噬细胞(Bone Marrow-Derived Macrophage,BMDM)和永生化骨髓来源巨噬细胞(Immortalized Bone Marrow-Derived Macrophage,IBMDM)1h,洗去未接种细菌,孵育4h或过夜后,应用ELISA和qRT-PCR的方法分别对细胞上清液中的IL-1β含量和细胞中的IL-1βmRNA表达水平进行检测。结果表明,接种并孵育过夜后可显著升高细胞上清液中的IL-1β含量和细胞中IL-1βmRNA的表达水平,孵育4h仅显著升高细胞中IL-1βmRNA的表达水平。对接种后BMDM的细胞上清液及细胞内IL-1β含量的Western Blot检测结果表明,仅孵育过夜可同时显著升高细胞上清液及细胞内的IL-1β含量,在接种前30min加入caspase-1抑制剂ZYVAD可显著抑制细胞上清液中的IL-1β含量,对细胞内的IL-1β含量无影响。将B.infantis和B.fragilis置于95℃水浴30min灭活后,接种小鼠BMDM和IBMDM均可显著增加IL-1β的生成,且与未灭活的B.infantis和B.fragilis作用无显著差异。在接种前30min加入细胞松弛素D(Cytochalasin D,Cyt D)抑制BMDM和IBMDM吞噬作用后,仅在B.fragilis接种IBMDM出现IL-1β生成的显著降低。B.infantis和B.fragilis接种小鼠IBMDM和NLRP3 KO IBMDM,ELISA检测细胞上清液中IL-1β含量的结果表明,B.infantis和B.fragilis接种的NLRP3 KO IBMDM后未见IL-1β含量显著升高,而在细胞培养基中加入KCl或使用离子通道阻断剂钌红(Ruthenium Red,RR)抑制细胞内钾离子的外流后,B.infantis和B.fragilis接种并引起IBMDM生成IL-1β的能力显著降低。接种未灭活的B.infantis和B.fragilisTHP-1巨噬细胞和人单核细胞来源巨噬细胞(Monocyte-Derived Macrophage,MDM)1h,洗去未接种细菌后孵育 4h,采用 ELISA和qRT-PCR的方法分别对细胞上清液中IL-iβ含量和细胞中IL-1βmRNA表达水平进行检测。结果表明,B.infantis和B.fragilis显著升高IL-iβ含量,ZYVAD显著抑制接种后THP-1巨噬细胞的IL-1β生成。Western Blot检测接种B.infantis和B.fragilis后THP-1巨噬细胞caspase-1活化水平的结果表明,B.infantis和B.ragilis显著增加THP-1巨噬细胞的caspase-1p10含量。升高细胞外液中的钾离子浓度或使用RR可显著抑制B.infantis和B.fragilis接种THP-1巨噬细胞和人MDM生成IL-1β,Cyt D对IL-1β的生成无显著作用。热灭活的Binfantis和B.fragilis同样可以引起人THP-1巨噬细胞和MDM以及小鼠BMDM生成IL-1β,与有活性细菌的作用之间无显著差异,CytD不影响IL-1β的生成,但KCl可显著抑制其生成。此外,试验采用Transwell将有活性的细菌与巨噬细胞分离,孵育过夜,通过ELISA和qRT-PCR检测细胞上清液中的IL-1β含量和细胞内IL-1βmRNA的表达水平。结果表明,有活性的B.infantis和Bragilis与巨噬细胞分离开后显著抑制细胞上清液中IL-1β的含量和细胞中IL-1β mRNA的表达水平。结论与创新:肠道共生菌B.infantis和B.fragilis通过黏附巨噬细胞引起巨噬细胞内的钾离子外流,进而激活NLRP3炎性小体,活化caspase-1,最终引起巨噬细胞生成成熟的IL-1β并分泌到细胞外。IL-1β引起人肝细胞BMP2或小鼠肝脏Activin B含量显著升高,致SMAD1/5/8蛋白的磷酸化,进而激活BMP信号通路,上调铁调素的表达。本试验首次阐明典型肠道共生菌B.infantis和B.fragilis可通过激活巨噬细胞NLRP3炎性小体而引起IL-1β生成,以及IL-1β通过激活BMP信号通路上调铁调素的表达,证实肠道共生菌引起巨噬细胞分泌的IL-1β是影响肝细胞和肝脏铁调素表达的效应分子。