沙门菌可以引发多种动物的胃肠道疾病,给养殖业和公共卫生造成重大威胁。随着抗生素耐药问题日益严重,研制高效的新型减毒疫苗是必要的。本研究通过自杀质粒介导的同源重组的方法,构建了一株鼠伤寒沙门菌AarcA△fnr△fliC减毒株,并在小鼠模型上评估了它的免疫原性和保护效果。1鼠伤寒沙门菌突变株的构建和鉴定本研究以鼠伤寒沙门菌ATCC14028为基础菌株,以调控基因arcA、fnr及鞭毛蛋白基因fliC为靶基因,通过自杀质粒介导的同源重组的方法构建了单基因突变株△arcA、△fnr、△fliC、双基因突变株△arcA△fnr和三基因突变株△arcA△fnr△fliC。经PCR鉴定靶基因被成功缺失。利用甲苯胺蓝固体培养基、M9低盐固体培养基及半固体LB培养基对各突变株的生长状况、泳动能力进行鉴定,结果证实,arcA、fnr突变导致菌株在相应平板上的生长受限以及fliC突变导致菌株运动能力显著下降,这表明各突变株被成功构建。2鼠伤寒沙门菌突变株部分生物学特性及毒力测定本研究对所构建的五株突变株进行部分生物学特性及毒力测定。结果显示,各突变株的体外生长曲线与野生株相似。arcA、fnr、fliC基因缺失会使细菌丧失运动能力,各突变株相比于野生株,其运动能力均显著降低。同时,小鼠感染试验证实,相比野生株,△fnr、△arcA△fnr、△arcA △fnr△fliC体内定殖能力显著下降;同时仅△arcA△fnr△fliC的半数致死量(LD50)显著升高,为1.3×109 CFU,是野生株LD50的接近104倍,其余突变株的毒力变化微弱。3鼠伤寒沙门菌△arcA△fnr△fliC免疫原性及保护效果评价本研究将△arcA△fnr△fliC以108CFU、107CFU两种剂量口服免疫小鼠,免疫两次,间隔28天,评估这一突变株的免疫原性和免疫保护效力。同时设置Acrp突变株阳性对照组(109CFU)和BSG阴性对照组。结果表明,同BSG组相比,△arcA △fnr△fliC两剂量组、Acrp组均产生高水平的血清IgG和粪便IgA抗体应答,血清IgG2a水平高于IgG1。同时血清杀菌实验证实各菌株免疫组二免后血清均能有效杀伤鼠伤寒沙门菌ATCC14028。进一步地,鼠伤寒沙门菌强毒株致死剂量攻毒后△arcA△fnr△fliC 108CFU剂量组、107CFU剂量组、Acrp组在派伊尔结、肝脏、脾脏的细菌载量均显著低于BSG组,同时分别提供87.5%、75%及完全的免疫保护。综上,本研究成功构建五株鼠伤寒沙门菌ATCC14028突变株,其中△arcA△fnr△fliC毒力高度减弱,并具有一定的免疫原性和较高的保护力。