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中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell,CHO)作为哺乳动物细胞真核表达系统,不仅能重组蛋白的天然结构,而且最大化保证了重组蛋白的生物学和免疫学功能,已广泛用于生产医用药物、细胞因子和单抗等生物制剂。由于生产成本高,还没有广泛用于生产兽用疫苗抗原及其生物制剂,也没有用于口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)重组抗原的生产。目前口蹄疫(Foot-and-mouth diseas,FMD)重组亚单位疫苗重组抗原的生产大多采用原核表达系统,并不能保证其抗原天然结构和生物学功能。因此,开发可高水平分泌表达具有天然结构的FMDV抗原的基因工程细胞系显得尤为重要,也是未来疫苗研究的发展趋势。为此,本研究以O型FMDV抗原表位为材料,CHO细胞为研究对象,利用CRISPR/Cas9介导的同源重组技术为手段,构建组成型高水平分泌FMDV抗原的基因工程细胞系,为规模化生产具有天然结构和功能的FMDV重组抗原提供生产用基因工程CHO细胞系。首先,利用信息学技术预测、筛选能提高CHO细胞分泌表达O型FMDV抗原表位(OME1)的信号肽,设计信号肽-(OME1)融合基因,构建不同信号肽-OME1的pCI-neo重组真核表达质粒,转染CHO细胞筛选能提供目的蛋白分泌表达的信号肽。WB结果显示,有9种信号肽促进OME1融合基因在CHO细胞内实现了分泌表达,其中SCGB1D1 isoform信号肽-OME1的重组蛋白量最高,是一种适合CHO细胞分泌表达FMDV重组抗原的信号肽。其次,以SCGB1D1 isoform信号肽和重新串联的O型FMDV抗原表位(OME2)为元件,能自组装病毒样颗粒(VLPs)的HBcAg为骨架,设计SCGB1D1 isoform-HBcAg-OME2融合基因,构建携带SCGB1D1 isoform-HBcAg-OME2融合基因的供体质粒,利用CRISPR/Cas9介导的同源重组技术将携带SCGB1D1 isoform-HBcAgOME2的融合基因整合到CHO细胞染色体的HPRT次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶基因和8号染色体端粒区,构建携带SCGB1D1 isoform-HBc Ag-OME2融合基因的基因工程CHO细胞。经抗性压力筛选300个CHO细胞岛,并对其进行了扩增培养,免疫荧光显微镜观察到克隆的CHO细胞有大量的绿色荧光,并对其进行鉴定,Junction PCR从克隆的CHO细胞基因组中检测到了SCGB1D1isoform-HBc Ag-OME融合基因,提示基因成功整合进CHO,WB结果显示,CHO细胞培养液中含有能与抗his-tag抗体和O型FMDV阳性血清发生免疫反应的蛋白质成分,再次证实,融合基因整合成功,而且以组成型分泌表达。充分说明本研究成功构建了能以组成型分泌表达FMD重组抗原的基因工程CHO细胞系。总之,本研究不仅筛选到了一种能够促进CHO细胞高效分泌表达FMDV抗原表位重组蛋白的信号肽,而且成功构建了能以组成型分泌表达FMD重组抗原的基因工程CHO细胞系,这将为利用该细胞系规模化生产具有天然结构,保证其生物学和免疫学功能的FMD疫苗重组抗原提供了物质基础和新线索。