脑卒中引起的脑损伤是神经外科常见的疾病，发病率和死亡率居脑血管病之首。根据原因可分为出血性脑卒中和缺血性脑卒中，无论是什么原因引起的脑损伤，神经功能的损伤将是不可逆转的。随着科研和临床研究的不断深化和发展，抗凝治疗、溶栓治疗和介入治疗取得了良好效果，但如何防止继发性脑损伤的也是目前临床面临的难题。继发性脑损伤脑功能的恢复有两个关键因素，即血管再生与神经细胞再生。干细胞移植和基因治疗相结合，为治疗脑损伤和神经功能的恢复带来了新的希望。骨髓间质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSCs），成为近年来研究的热点，由于其来源丰富，采集方便同时具有较小的免疫反应性，目前已广泛应用在各个领域。低氧诱导因子1α (hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α）是一种重要的转录因子，广泛表达于哺乳动物体内，参与并保持在体内的氧平衡，在病理条件下对缺血缺氧反应产生应答，目前已知有70多个靶基因。在这项研究中，我们使用重组腺病毒HIF-1α基因转染骨髓间充质干细胞移植到局灶性脑缺血再灌注（MCAO）模型，进一步研究HIF-1α的脑损伤保护作用。通过研究，我们发现，HIF-1α的可促进下游靶基因上调，从而促进血管新生，改善脑组织的血液供应，减少脑组织缺血、缺氧损伤。研究同时还发现，HIF-1α可促进骨髓间充质干细胞向神经干细胞（NSCs）分化和维持神经干细胞的特点。本实验分为四个部分：第一部分：骨髓间充质干细胞的分离、培养与鉴定目的：通过分离培养骨髓间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSCs），鉴定其生物学特性，为组织的基因治疗提供实验依据。方法：采用密度梯度离心法分离MSCs，倒置相差显微镜观察MSCs的形态学变化；MTT测定细胞生长曲线；细胞表型通过流式细胞仪进行鉴定；利用光镜观察分化能力。结果：密度梯度离心法能分离出较高纯度的MSCs。流式细胞仪显示：CD29(93.2%)、CD105(92.6%)、CD45(94.68%)、CD44(94.6%)、CD73(86.4)、CD34(1.5%)、CD45(2.2%)、CD19(2.0%)、CD14(1.9%)。细胞生长曲线可见细胞增殖的最高峰出现在第6至7d，其后细胞增殖速度迅速下降。光镜下观MSCs能够在体外诱导分化成为成骨细胞与脂细胞。结论：采用密度梯度离心法成功的分离出高纯度的MSCs是有效的方法。第二部分重组腺病毒载体Ad. HIF-lα转染MSCs目的：构建重组腺病毒Ad. HIF-lα并转染MSCs，观察转染HIF-lα外源性基因及蛋白在MSCs中的表达。方法：将在目的基因HIF-lα的上游引入BamH I酶切位点，下游引入Xba I酶切位点，对质粒pcDNA3.1/HIF-lα进行双酶切鉴定，测序。体外分离、培养MSCs，腺病毒载体与HIF-lα基因连接，转染MSCs，用Western blot检测HIF-lα蛋白表达。结果：双酶切鉴定、测序和Western blot结果显示HIF-lα基因成功转入腺病毒载体，并且能够在MSCs中表达。结论：成功构建了重组腺病毒Ad. HIF-lα，并转染到MSCs中。第三部分：腺病毒介导的HIF-1α基因转染MSCs对脑损伤后血管生成、神经干细胞增殖分化的影响目的：观察低氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α）基因对大鼠脑缺血再灌注后血管生成的影响，探讨HIF-1对神经干细胞人（Neuralstem cells，NSCs)增殖与分化的作用机制。方法:建立大鼠大脑中动脉缺血再灌注(Ischemic reperfusion injury, I/R)模型，大鼠随机分为PBS组、MSC组和Ad-HIF-1α转染MSC (Hy-MSC组)。分别将PBS、MSCHy-MSC定位注射到I/R模型大鼠脑缺血区，于7d、14d、21d进行神经功能缺失评分(Neurological deficit score,NDS)并比较。免疫组化检测HIF-1α的表达，Westentblot检测皮层VEGF、EPO和Ang-1的表达，TUNEL检测细胞的调亡情况。结果:（1）Hy-MSC组在第7、14、21d的NDS优于MSC组PBS组（P<0.05）；（2）与MSC组相比, Hy-MSC组增强了各时间点HIF-1、VEGF及EPO的表达；（3）Hy-MSC组和MSC细胞数明显，但凋亡率下降，与PBS相比细胞调亡率(P<0．05)。结论: HIF-1α基因可促进大鼠局灶性脑缺血后血管生成，同时促进MSCs向神经干细胞分化，并维持NSCs的特性。第四部分HIF-1α与Wnt信号途径的关系以及对NSCs特性的影响目的：观察HIF-1α对Wnt信号途径的相互关系，以及在MSCs向NSCs分化、增殖中作用。方法:体外培养大鼠NSCs以及HIF-1α转染后的骨髓间充质干细胞（Hy-MSC）,利用免疫共沉淀观察两者之间存在联系。为进一步证实上述结果，分别加入HIF-1α与Wnt的活化剂与抑制剂，通过Westernblot观察下游基因血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）、促进细胞生成素（Erythropoietin，EPO）、淋巴增强因子（Lymphoidenhancer factor-1，LEF-1）、β-链蛋白（β-catenin）表达的变化。结果：（1）阻断HIF-1α的表达，Wnt下游基因表达减少LEF-1（P <0.01）和β-catenin（P <0.05）。（2）阻断Wnt的表达，对HIF-1α下游基因VEGF和EPO无明显影响。（3）阻断Wnt的表达, HIF-1α的表达无影响。结论： HIF-1α调节骨髓间充质干细胞向神经干细胞分化与增殖是通过调节Wnt信号转导通路实现的。