植物类病毒病害如马铃薯纺锤形块茎病、苹果锈果病等在我国长期存在,是农业生产的重要威胁,迄今仍无有效化学药剂可用。虽然抗病育种是首选防治措施,但周期长、抗性资源少等问题限制了其应用,难以满足生产实际的需要。近年来,RNA干扰（RNA interference,RNAi）技术的出现及应用为类病毒病害的防治提供了新思路和方法。该技术的理论依据是,病毒及类病毒的侵染会激活宿主的RNA沉默（RNA Silencing）,而RNA沉默是植物防御病毒及类病毒侵染的重要免疫机制。尽管已经有一些应用RNAi技术成功防治植物病毒病害的例子,但至今为止仍未有利用该技术成功防治类病毒病害的田间应用实例。造成此问题的重要原因之一是没能清楚地了解RNA沉默在植物防御类病毒侵染中的作用机制。Dicer-like酶（DCL）、Argonaute蛋白（AGO）,依赖于RNA的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA ploymerase,RDR）是一类RNA沉默途径中的重要蛋白。揭示这些蛋白在植物防御类病毒侵染中的作用及机制是当前类病毒研究领域的前沿及热点。研究发现DCL2和DCL3蛋白的协同作用在本氏烟防御马铃薯纺锤形块茎类病毒（potato spindle tuber viroid,PSTVd）侵染中至关重要。此外,还发现RDR6的表达不仅可以延缓PSTVd在本氏烟的积累,而且能够阻止PSTVd进入茎尖分生组织。RDR1是RNA沉默途径中的重要蛋白,也是植物通过RNA沉默防御病毒侵染所必需的。虽然DCLs和RDR6在植物防御类病毒侵染中具有重要作用,但是仍不能确定RDR1是否有类似的功能。因此,本研究拟综合运用植物病毒学、分子生物学、遗传学及生物信息学等方法,使用病毒诱导的基因沉默（Virus-induced gene silencing,VIGS）和过表达转基因等技术,改变番茄,黄瓜和本氏烟RDR1基因的表达水平。通过接种类病毒,分析RDR1基因表达水平的变化对类病毒侵染及类病毒诱导的RNA沉默的影响,从而明确其在植物防御类病毒侵染中的作用。此外,利用小RNA（small RNA,s RNA）测序技术,分析RDR1蛋白的表达与类病毒来源的小RNA（Viroid-derived small RNAs,vd-s RNAs）之间的关系,并找出RDR1特异性扩增的vd-s RNAs,从而解析RDR1参与植物防御类病毒侵染的分子机制。本研究首次探究了RDR1蛋白与植物防御类病毒的关系,研究结果丰富了我们对植物类病毒与宿主相互作用的认知,也为植物类病毒病害的防治提供了新思路和新方法。一、RDR1基因表达对类病毒侵染和水杨酸的响应已有报道发现植物激素水杨酸（Salicylic acid,SA）参与植物的抗病毒免疫,且RDR1参与了SA诱导的植物抗病毒免疫途径。另外,啤酒花矮化类病毒（hop stunt viroid,HSVd）侵染黄瓜会诱导叶片中RDR1基因的表达。因此,在开展RDR1蛋白与类病毒的互作关系研究之前,首先调查了RDR1基因对类病毒侵染以及SA处理的表达响应:使用农杆菌介导法将PSTVd致病株接种番茄,4 d后利用反转录荧光定量PCR法检测发现番茄（Solanum lycopersicum）RDR1基因（Sl RDR1a）在受PSTVd侵染番茄中的表达量是对照组的1.5倍,说明PSTVd侵染可以诱导番茄Sl RDR1a基因的表达;使用终浓度为2 m M的SA或缓冲液,分别喷洒番茄叶片的正面和背面。利用荧光定量PCR法检测Sl RDR1a基因的时序表达变化,发现番茄Sl RDR1a的转录本在SA处理后6 h开始增加,并在24 h时达到最高表达量,为对照组的5.1倍;然而,在24 h后Sl RDR1a表达水平迅速下降。以上结果表明PSTVd侵染和水杨酸处理均可以诱导番茄Sl RDR1a基因的表达。二、RDR1基因表达水平的变化对类病毒侵染的影响RDR1是RNA沉默途径中的重要蛋白,而RNA沉默是植物防御病毒及类病毒侵染的重要免疫机制。因此,RDR1可能通过RNA沉默参与了植物对类病毒侵染的防御。为证实该推测,将通过多种分子生物学和遗传学技术,改变RDR1基因在宿主的表达丰富,并分析其对类病毒侵染的影响。（1）过表达RDR1基因对类病毒侵染的影响本氏烟天然缺失RDR1同源基因,是研究RDR1基因功能的良好实验材料。以HSVd/本氏烟和PSTVd/本氏烟为实验组合,利用转基因技术在本氏烟过表达RDR1。接种类病毒后,观察植株表型并检测类病毒的浓度,通过与野生型植株的比较,验证RDR1基因表达水平的提高是否会抑制类病毒的侵染,进而减轻类病毒的致病性:使用转基因技术在本氏烟超表达烟草（Nicotiana tabacum）RDR1基因（Nt RDR1）和黄瓜（Cucumis sativus）RDR1基因（Cs RDR1c1）,接种PSTVd,发现过表达Nt RDR1或Cs RDR1c1的本氏烟能在侵染初期（14～21 d）延缓PSTVd基因组RNA的积累,但是在侵染后期（28 d～）抑制作用不明显,且过表达Nt RDR1蛋白不能阻止PSTVd造成的本氏烟植株矮化表型。另外,将转Nt RDR1基因的本氏烟接种HSVd,发现Nt RDR1过表达不仅能延缓HSVd基因组RNA的积累,还能抑制HSVd对本氏烟的矮化致病,减轻系统叶花叶和卷曲的症状表型。（2）下调表达RDR1基因对类病毒侵染的影响以PSTVd/番茄为实验组合,利用病毒诱导的基因沉默（VIGS）技术,对番茄的Sl RDR1a进行基因敲减。接种PSTVd后,观察表型并检测PSTVd的浓度,通过与野生型番茄相比较,验证Sl RDR1a基因表达水平的降低是否会促进PSTVd侵染并增强其致病性。首先通过烟草脆裂病毒（tobacco rattle virus,TRV）介导的基因沉默系统下调表达番茄的Sl RDR1a基因,再接种PSTVd发现,Sl RDR1a m RNA的丰度与PSTVd致病严重程度之间存在明显的相关性。即Sl RDR1a基因的下调表达增加了番茄对PSTVd侵染的敏感性,导致了较严重的叶脉坏死,卷叶皱缩以及植株矮化的症状,同时PSTVd在番茄系统叶的积累量也显著提高。三、RDR1基因介导植物防御类病毒侵染的分子机制一方面,RDR1作为RNA聚合酶,其可能通过RNA沉默介导植物对类病毒的防御。RDR1以植物体内产生的单链类病毒RNA片段为模板,扩增出双链RNA,经不同DCL蛋白的切割,产生更多类病毒来源的小RNA（vd-s RNAs）,增强RNA沉默,从而提高植物对类病毒的防御能力。此外,植物激素参与的信号转导是调控植物生长发育及代谢的重要途径,RDR1与植物激素合成调控的关系也比较密切。基于此,需要验证RDR1基因表达丰度的变化是否会影响植物体内vd-s RNAs的积累,或者是否参与了植物激素介导的抗类病毒途径。因此,将使用Northern blotting和s RNA测序技术,测定野生型以及过表达RDR1基因植株中vd-s RNAs的浓度。此外,运用生物信息学分析RDR1特异性扩增的vd-s RNAs,并明确其分子特征,包括大小以及在基因组上的位置。同时探究RDR1抗类病毒功能与相关植物激素通路的关系,综合解析RDR1防御类病毒侵染的分子机制。（1）RDR1基因表达水平的变化与植物体内vd-s RNAs积累的关系小RNA杂交发现,超表达Nt RDR1的本氏烟在抑制PSTVd基因组RNA积累的同时,也抑制了PSTVd-s RNAs的积累,说明PSTVd侵染转Nt RDR1基因本氏烟后类病毒积累量的减少不是由PSTVd-s RNAs的有效积累引起的。进一步利用高通量测序鉴定PSTVd-s RNAs的积累和数量特征,发现从PSTVd侵染的空载体（empty vector control,EC）转基因植物中获得的PSTVd-s RNAs总数[75659条每百万条读数（Per million readings,RPM）]大约是Nt RDR1转基因植物中（39835/RPM）的两倍,且来自PSTVd基因组链（+）的reads数量均低于来自互补基因组链（-）。此外,21 nt长度的PSTVd-s RNAs在EC和转Nt RDR1基因本氏烟中占有的比重均最大,s RNA序列分布图谱发现其在PSTVd基因组正负链上的分布偏向于几个热点核苷酸区域（如正链193～266 nt,负链的152、196、252和346 nt位点等）,两组s RNAs在PSTVd基因组链的分布热点模式基本一致,但仍有一些不同的分布特征,这些差异的特征可能与RDR1蛋白的功能有关。该研究为后续寻找RNA切割靶点奠定了基础。（2）RDR1基因表达水平的变化与SA激素通路的关系为了探究SA与番茄抵御PSTVd侵染之间的关系,研究发现番茄外源喷施SA可以诱导Sl RDR1a的基因快速表达,在侵染PSTVd后延缓了类病毒在番茄的积累,进而增强寄主对PSTVd侵染的抗性。然而,沉默番茄Sl RDR1a基因后进一步喷施SA则不能显著提高番茄中Sl RDR1a m RNA的转录,但是外源喷施SA可以部分恢复Sl RDR1a沉默番茄对PSTVd的抗性,说明SA可能也参与调控了番茄除RDR1依赖的其他类病毒防御途径。研究结果为番茄Sl RDR1a蛋白和SA通路在应对PSTVd侵染之间的相互关联提供了依据。