【摘 要】
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目的:牙周炎是一种复杂的炎症性疾病,临床症状包括牙龈炎症、牙槽骨吸收、附着丧失等,严重时可导致牙齿脱落。牙龈卟啉单胞菌是牙周炎的主要致病菌,可局部侵入牙周组织,逃避宿主的防御机制,并分泌多种毒力因子造成牙周组织破坏和牙槽骨吸收。细菌、真菌和病毒感染均可引起外泌体从宿主细胞中形成和释放。外泌体在细胞外循环的过程中通过转运其来源细胞的脂质、蛋白质和核酸来调节受体细胞的生物活性,发挥调控靶细胞的作用。牙
【基金项目】
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国家自然科学基金（No.81970942）； 辽宁省教育厅基金（JC2019024）；
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目的:牙周炎是一种复杂的炎症性疾病,临床症状包括牙龈炎症、牙槽骨吸收、附着丧失等,严重时可导致牙齿脱落。牙龈卟啉单胞菌是牙周炎的主要致病菌,可局部侵入牙周组织,逃避宿主的防御机制,并分泌多种毒力因子造成牙周组织破坏和牙槽骨吸收。细菌、真菌和病毒感染均可引起外泌体从宿主细胞中形成和释放。外泌体在细胞外循环的过程中通过转运其来源细胞的脂质、蛋白质和核酸来调节受体细胞的生物活性,发挥调控靶细胞的作用。牙槽骨吸收是牙周炎的主要症状之一,而破骨细胞是造成骨吸收的主要细胞。本实验利用牙龈卟啉单胞菌作用下巨噬细胞源性外泌体刺激破骨细胞,采用qRT-PCR和免疫荧光检测NFATc1、TRAF6和RANK的表达情况,观察外泌体对破骨细胞分化的影响。研究方法:1.体外培养U937细胞,加入PMA诱导为巨噬细胞。2.体外培养P.gingivalis W83,液体增菌后检测细菌浓度。3.将巨噬细胞分为实验组和对照组,其中实验组按MOI=100∶1的比例加入P.gingivalis W83,对照组加入等体积的培养液。4.分别收集实验组和对照组细胞上清,采用超速离心法提取外泌体,PBS重悬后可长期保存于-80℃冰箱,加入P.gingivalis组和未加入P.gingivalis组外泌体分别表示为EXO-P和EXO-N。5.通过透射电子显微镜（Transmission electron microscope,TEM）、纳米颗粒追踪技术（Nanoparticle tracking analysis,NTA）及免疫蛋白印迹（Western blot,WB）检测手段对外泌体进行鉴定。6.体外培养U937细胞,经PMA和1,25（OH）2VD3序列诱导为破骨细胞。7.利用抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色鉴定破骨细胞。8.分别用浓度为40μg/m L的外泌体EXO-N和EXO-P刺激破骨细胞,实验分为对照组、EXO-N组和EXO-P组。9.分别提取对照组、EXO-N组和EXO-P组细胞的总RNA,实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）检测NFATc1、TRAF6、RANK基因表达。10.免疫荧光检测对照组、EXO-N组和EXO-P组NFATc1、TRAF6、RANK蛋白表达。结果:1.EXO-N组及EXO-P组外泌体在透射电镜下均可观察到双层膜的类盘形囊泡状结构,NTA检测结果显示EXO-N组外泌体平均粒径为128.6 nm,EXO-P组外泌体平均粒径为133.9 nm,Western blot结果显示EXO-N组及EXO-P组外泌体均可表达表面蛋白CD9、CD81和Alix。2.U937细胞经PMA和1,25（OH）2VD3序列诱导为破骨细胞。3.EXO-P组与对照组、EXO-N组相比,NFATc1、TRAF6、RANK表达增加,而EXO-N组与对照组相比,以上指标均无明显差异。结论:P.gingivalis W83感染巨噬细胞所释放的外泌体可以促进破骨细胞分化,为牙周骨免疫学研究提供了新的思路。
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