肝癌是我国高发病率和高死亡率的肿瘤,严重威胁国人健康。近年来,随着放射治疗技术的发展,放射治疗再次被应用于肝癌。多个临床研究证明,放射治疗可以有效治疗肝癌,并提高不能手术单纯依靠TACE治疗的肝癌患者的生存率。目前,放射治疗已经作为不能手术切除肝癌的治疗方式之一写入临床指引,国内肝癌规范化治疗专家建议不能手术或无法手术切除的肝癌患者选择放射治疗。但是,在临床应用中,我们仍然看到肝癌放射放射治疗的不足之处:首先,不能手术切除的肝癌患者的肿瘤体积常常较大、或/和侵犯血管,出现肝内播散和远处转移的几率大于其他肝癌患者,而放射治疗作为一种局部治疗,无法解决肝内播散和远处转移的问题；其次,受周围正常组织放射耐受剂量限制,肝内肿瘤的照射剂量无法提高,严重影响肝放射治疗的疗效。因此,肿瘤学家们常常将放射治疗与其他治疗方式联合应用,例如放射治疗加TACE。临床上已经证实,放射治疗联合TACE对比单纯TACE疗效提高。但是,这种综合治疗模式同样存在问题。首先,放射治疗是否需要联合TACE不明确,放射治疗联合TACE与与单纯放射治疗比较并没有观察到明显的疗效优势。其次,化疗药物本身对肝癌的有效率较低,目前未发现治疗肝癌有长期疗效的化疗药物。再次,化疗有可能增加放射治疗引起的周围正常组织放射后损伤,限制放射治疗剂量提升。因此,临床上需要更有效、低毒的药物与放射治疗联合。Sorafenib是新开发的口服多种激酶抑制剂,一方面抑制包括C-Raf、B—Raf在内的Ser/Thr蛋白激酶活性,阻碍Raf/MEK/ERK通路的信号传导,诱导肿瘤细胞凋亡；另一方面,抑制多种与新生血管生成和肿瘤发展相关的受体的酪氨酸激酶活性,阻断肿瘤新生血管生成,间接抑制肿瘤细胞生长。经过临床Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期试验证实,Sorafenib是第一个可以延长晚期肝癌患者生存时间的药物,在亚洲的Ⅲ期临床试验结果显示,对不同亚组患者Sorafenib均体现了生存优势,即患者的年龄、肿瘤血管侵犯情况、是否合并肝外转移和是否HBV感染不影响药物的作用效果。但是同时也发现,Sorafenib使用后肿瘤消退比例小。放射治疗与Sorafenib存在作用互补的可能,研究者们也在关注二者联合应用的可能性,但是目前研究仍较少。本研究主要探讨放射治疗与Sorafenib联合应用的可能性,为以后的研究提供理论根据。另外,参考其他抗血管生成药物与放射治疗联合的研究,我们发现多种抗血管生成药物具有放射增敏作用,并且不同加药时间影响严重联合作用效果。因此,我们在研究中还需要考虑Sorafenib不同加药时间对放射疗效的影响,选择最佳的联合作用模式。　　 第一部分肝癌细胞的放射生物学特性　　 背景与目的：　　 为详细了解肝癌细胞的放射生物学特性,选择合适的肝癌细胞株进行进一步实验,本研究使用放射后细胞集落形成的方法观察不同肝癌细胞受照射后的细胞克隆性生长特性,并计算不同肝癌细胞的放射生物学参数。　　 材料与方法：　　 肝细胞癌细胞株Hep G2、SMMC-7721、Bel-7402,100NBS血清RPMI-1640培养液常规培养。细胞种六孔板,钴60治疗机照射0～10Gy,照射后计算细胞克隆数。根据单击多靶和二次线性数学模型分别拟合细胞存活曲线,计算单击多靶模型参数D0、Dq、N和二次线性模型参数α、β、α/β。　　 结果：　　 Hep G2、SMMC-7721、Bel-7402细胞的DO分别为1.73Gy、2.18Gy、1.81Gy,N分别为3.26、1.03、2.73,α分别为6.41×10-2、43.65×10-2、10.8×10-2,β分别为5.76×10-2、0.37×10-2、5.08×10-2。　　 结论：　　 不同种类肝癌细胞的放射敏感性存在较大差异,其中SMMC-7721放射较敏感,HepG2和BEL-7402放射敏感性较低。　　 第二部分放射不同时间联合Sorafenib对肝癌细胞的作用　　 背景与目的：　　 在抗血管生成药物与放射治疗联合的研究中发现,多种抗血管生成药物有放射增敏作用,并且作用结果与加药时间密切相关。新的抗血管生成药物Sorafenib临床上已证明其抗肝癌肿瘤生长的作用,本研究进一步明确其与放射治疗联合对肝癌的体外抑制作用,并寻找最合适的加药时间。　　 材料与方法：　　 人肝细胞癌细胞株SMMC-7721、BEL-7402,10％NBS血清RPMI-1640培养液常规培养。CCK-8试剂盒检测不同浓度Sorafenib作用不同时间对肝癌细胞增殖抑制作用,选择Sorafenib作用24小时的IC30作为放射联合Sorafenib研究的药物浓度。放射后细胞克隆形成观察放射不同时间联合Sorafenib作用于肝癌细胞,培养后细胞克隆形成数,绘制细胞生存曲线,明确放射不同时间联合Sorafenib对肝癌细胞克隆性生长的抑制作用。观察单纯Sorafenib对肝癌细胞的作用,PI单染、细胞流式分析Sorafenib作用不同时间肝癌细胞的细胞周期分布,Western blot技术分析Sorafenib作用不同时间细胞内CyclinD1表达。免疫荧光技术观察放射同时联合Sorafenib对放射后不同时间肝癌细胞内γ-H2AX聚焦点的形成、残留情况,并计数DNA双链受损伤的阳性细胞,Western blot技术分析放射同时联合Sorafenib放射后γ-H2AX表达和ERK激活。PI单染、流式细胞分析单纯放射、放射前加入Sorafenib和放射后24小时加入Sorafenib肝癌细胞不同时间的细胞周期分布,比较Sorafenib和PD98059在细胞周期分布影响的区别,Western blot技术分析分析Sorafenib和PD98059对放射后细胞内ERK激活的影响。MTS比色法检测经过单纯Sorafenib、单纯放射、放射前加入Sorafenib和放射后24小时加入Soraenib处理后肝癌细胞的增殖抑制,Annexin V-FITC/PI双染观察经过不同处理后48小时肝癌细胞凋亡情况。　　 结果：　　 1.Sorafenib对不同肝癌细胞的增殖抑制作用相似　　 Sorafenib对肝癌细胞Hep G2、SMMC-7721、BEL-7402的增殖抑制作用呈时间和浓度依赖性,随浓度的增加和作用时间延长,对细胞增殖作用逐渐增强。24小时Hep G2、SMMC-7721、BEL-7402细胞的IC50分别为29.1±1.7uM、26.4±0.3uM、25.5±0.9uM。取细胞IC30作为放射联合Sorafenib实验的药物浓度。　　 2.Sorafenib对放射后肝癌细胞克隆形成的影响与不同加药时间相关　　 与单纯放射比较,SMMC-7721和BEL-7402细胞照射前30min加入Sorafenib,细胞的克隆形成数均增加；照射后24H加入Sorafenib,克隆形成数减少。SERSF2表是2Gy照射的细胞增敏比,放射前联合Sorafenib在两种肝癌细胞(SMMC-7721和BEL-7402)的放射增敏比分别为0.78和0.88均小于1,而放射后24小时联合Sorafenib的放射增敏比分别为1.43和1.23均大于1。　　 3.单纯Sorafenib降低肝癌细胞内CyclinD1表达,对细胞周期分布影响不明显　　 加入Sorafenib后不同时间检测细胞周期分布,与对照组比较未发现无明显变化。WB检测发现加入Sorafenib1小时以上肝细胞内Cyclin D1蛋白表达降低,放射前30分钟内加入Sorafenib对细胞周期和周期蛋白表达影响不大。　　 4.放射前加入Sorafenib提高放射后肝癌细胞的DNA修复能力　　 4.1 Sorafenib不影响放射引起的肝癌细胞DNA损伤　　 照射后30分钟SMMC-7721和BEL-7402细胞单纯放射、放射联合Sorafenib处理后DNA受损伤的阳性细胞比例分别为:94.6±3.5％、93.9±4.7％(P=0.954)和64.7±2.9％、62.7±4.O％(P=0.873),两组间无明显差异。放射后γ-H2AX表达明显上升,但是放射前加入的Sorafenib对放射后γ-H2AX表达无影响。　　 4.2 Sorafenib增强肝癌细胞对DNA损伤的修复能力　　 经单纯放射或放射联合Sorafenib处理后6小时,SMMC-7721和BEL-7402细胞内DNA受损阳性细胞比例分别为:59.9±2.4％、23.8±2.9％(P<0.001)和46.4±3.8％、25.0±3.0％(P<0.001),放射前加入Sorafenib减少放射后6小时细胞内γ-H2AX焦点残留。　　 5.Sorafenib增强放射后G1期阻滞,作用与MAPK信号传导通路阻断部分相关　　 5.1 Sorafenib增强放射后细胞的G1期阻滞　　 放射后12小时检测,放射前加入Sorafenib组与单纯放射相比,G0/G1期细胞比例上升(SMMC-7721:32.7±5.1％vs6.9±1.9％,P=0.001；BEL-7402:45.5±4.1％vs32.4±2.3％,P=0.002)；G2/M期细胞比例下降(SMMC-7721:27.1±2.5％vs56.3±2.7％,P<0.001；BEL-7402:18.1±4.1％vs27.9±3.3％,P=0.034)。　　 在SMMC-7721细胞中,放射后24小时加入的Sorafenib增加G0/G1期细胞比例,放射后36小时,对照组、单纯放射组、放射后24小时联合Sorafenib组G0/G1期细胞比例分别为57.5±2.8％、29.1±1.5％、58.8±4.7％,单纯放射组与放射后24小时加入Sorafenib组比较P=0.01。　　 5.2 Sorafenib抑制放射后ERK的过度激活是引起放射后BEL-7402细胞G1期阻滞的部分因为　　 放射前加入PD98059与Sorafenib相似,均降低放射后细胞内ERK激。在SMMC-7721细胞中,放射前加入PD98059对放射后周期分布无影响。在BEL-7402细胞中,放射前加入PD98059增加了放射后12小时G0/G1期细胞比例,但细胞比例升高幅度较放射前加入Sorafenib低,单纯放射、放射前联合Sorafenib、放射前联合PD98059放射后12小时检测G0/G1期细胞比例分别为:32.4±2.3％、48.0±2.7％、39.9±1.6％,两两比较差异有统计学意义(P=0.002)。　　 6.放射前加入Sorafenib延迟放射后G2/M期细胞阻滞、延缓放射后细胞周期进程,放射后24小时加入Sorafenib放射24后G2/M期细胞比例升高消失　　 放射前加入Sorafenib处理与单纯放射处理细胞相似,放射后出现G2/M期阻滞,G2/M期细胞比例最高峰值接近。两种处理放射后细胞周期分布区别在于:1、放射前加入Sorafenib处理的细胞较单纯放射处理细胞,放射后出现G2/M期细胞比例升高延缓；　　 2、放射后G2/M期细胞比例升高的持续时间延长。　　 7.放射后24小时加入Sorafeaib增加放射引起的肝癌细胞增殖抑制和细胞凋亡,放射前加入Sorafenib对放射后肝癌细胞增殖及凋亡影响不明显　　 放射后24小时联合Sorafenib明显增加放射引起的肝癌细胞增殖抑制。AnnxinV-FITC/PI双染进行凋亡检测,放射后48H检测凋亡(早期凋亡+晚期凋亡),放射前加入Sorafenib与单纯放射处理后凋亡细胞比例比较无明显差异(SMMC-7721细胞P=0.127,BEL-7402细胞P=0.387),放射后24小时加入Sorafenib较单纯放射、放射前加入Sorafenib凋亡细胞比例明显增加。　　 结论：　　 Sorafeinib可以增加放射对肝癌细胞的生长抑制,但是联合作用结果与加药时间密切相关。放射前加入Sorafenib:①照射前不降低CyclinD1表达,对肝癌细胞周期分布无明显影响；②照射后不改变射线引起的DNA损伤,但是加快DNA损伤修复,同时增加G1期细胞阻滞、延迟细胞周期进程,延长细胞进入下一次有丝分裂的时间,DNA修复时间加长,最终对放射后肝癌细胞凋亡和增殖抑制影响不大,甚至增加放射后克隆性生长的细胞数。放射后24小时加入Sorafenib引起相似的细胞周期改变,即G1阻滞加强,细胞周期也可能同时延长,但是由于加入Sorafenib时放射引起的DNA损伤已经基本修复,因此细胞周期延长不影响放射后DNA损伤修复,反而降低细胞的生长增殖能力,最终表现为放射后肝癌细胞凋亡和增殖抑制增加、克隆生长细胞减少。