基因印迹(gene imprinting))是指亲源依赖性单等位基因表达,即只有一个父源性或母源性等位基因表达,也称亲代印迹(parentalimprinting)。具有这种现象的基因被称为印迹基因(imprinted gene)。传统的孟德尔规律指出:胚胎从父亲和母亲遗传的两个拷贝,即等位基因(alleles)均有同等的机会表达,与其亲代来源无关。基因印迹不遵循经典的孟德尔遗传,是一种非遗传性基因调控方式,为一种表观遗传修饰现象,其修饰方式主要为DNA甲基化。基因印迹发生于配子形成过程中,可影响卵泡成熟,胚胎形成、发育、胎儿生长及胎盘分化,印迹中心(imprinting centre,IC)的印迹异常则导致流产、死胎、畸型及智力障碍等一系列遗传性印迹疾病,以及儿童和成人与基因印迹相关的肿瘤。目前,在卵母细胞和胚胎早期印迹基因的表达、印迹形成、辅助生殖技术(assisted reproductive technology,ART)的体外培养和显微操作等技术是否干扰了印迹基因的甲基化印迹状态等问题,已成为生殖医学及遗传学研究的热点。自首例体外受精(in vitro fertilization,IVF)婴儿1978年在英国诞生后,胞浆内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)于1992年成功应用于治疗男性不育,ART做为治疗不孕的重要技术已在世界范围内广泛应用。近年来美、英、德等很多国家研究提出ART的体外培养和显微操作可能干扰了卵母细胞或早期胚胎印迹基因的甲基化印迹状态,从而导致基因印迹疾病,如:韦-伯综合征(Beckwith-Wiedemannsyndrome,BWS)和安吉尔曼综合征(Angelman syndrome,AS)等遗传性印迹疾病,Halliday等比较1316500例自然怀孕出生的孩子和14894例经ART出生的孩子的发病率,发现BWS的发病风险ART人群比正常人群高9倍,同时报道7例经ART出生的BWS患者,其中6例存在父源性印迹基因KCNQ1OT1或H19的印迹缺失。Orstavik和Cox等报道经ICSI出生的3例AS患儿,都是由于母源性表达的基因UBE3A在染色体15q11-13区域的印迹丢失而发病。在ART出生患儿中70%的BWS和100%的AS患者存在母源性等位基因甲基化异常,导致印迹丢失,而在普通患者中仅有50%-60%的PWS和5%的AS患者各存在甲基化异常。另外,人类胚胎干细胞体外培养,是否干扰了胚胎干细胞的基因印迹状态也需要进一步研究。由于人类卵母细胞和胚胎的来源及相关伦理问题的限制,且标本仅含单个细胞至数个细胞,mRNA含量极微,实验室条件要求高,技术难度大,其相关研究多以动物为主,对人类的研究,仅国外少量文献报道了IGF2、H19等数条印迹基因在卵母细胞及植入前胚胎中的表达。而与PWS相关的印迹基因SNRPN、NDN,与AS相关的印迹基因UBE3A,与BWS相关的印迹基因KvLQT、MASH2,与SRS相关的印迹基因PEG1等,在人类卵母细胞及植入前胚胎的表达情况报道极少,与SRS相关的候选印迹基因PEG10、ASB4,目前国内外尚未见报道,本研究应用单细胞巢式RT-PCR技术,对SNRPN、NDN、UBE3A、KvLQT1、MASH2、PEG1、PEG10、ASB4等与印迹疾病相关的8个印迹基因进行mRNA检测,旨在了解人类印迹基因在卵母细胞和植入前胚胎的表达情况,以对其各种异常表达情况、ART与印迹疾病的关系和印迹基因调控机制进行初步探讨,为遗传性印迹疾病的PGD开展奠定理论和实验基础。同时,本研究针对临床疑为PWS患儿,对该患儿及其父母从染色体及基因水平对15q11-13区带的印迹基因SNRPN是否微缺失、易位、单亲二倍体等进行检测,对其病因从分子水平做出精确诊断,以对其父母再次妊娠作出遗传指导,避免PWS患儿再次出生,从产前水平甚至从胚胎植入前水平阻断PWS的发生提供实验依据。第一章印迹基因在人类卵母细胞及植入前胚胎mRNA表达目的:研究印迹基因在人类卵母细胞和植入前胚胎中的mRNA表达,对其生物学意义、印迹调控机制、ART与印迹疾病的关系的探讨,并为开展胚胎植入前遗传学诊断提供理论和实验依据。方法:选择北大深圳医院辅助生殖医学中心2005年6-9月IVF、ICSI废用的GV、MⅠ、MⅡ的卵母细胞,2、4、8细胞胚胎及囊胚。或者经IVF/ICSI-ET治疗后已出生健康儿、自愿捐献多余冻存的胚胎。无遗传病家族史。经患者同意及医院医学伦理协会同意。在倒置显微镜下去除透明带,细胞裂解,cDNA制备,应用单细胞巢式PCR技术,对SNRPN、NDN、UBE3A、KvLQT1、MASH2、PEG1、PEG10、ASB4等与印迹疾病相关的8个印迹基因进行mRNA检测,并对其中SNRPN、UBE3A基因进行PCR产物纯化、连接转化、摇菌提取质粒测序验证。结果:1.SNRPN、PEG1基因卵母细胞在GV、MⅠ、MⅡ期,胚胎在2、4、8细胞及囊胚阶段均有mRNA的表达2.UBE3A基因自卵母细胞MⅠ期开始表达,维持表达至整个植入前胚胎3.NDN基因表达于卵母细胞GV、MⅠ、MⅡ及胚胎8细胞与囊胚阶段4.KvLQT1基因各期卵母细胞及植入前胚胎均无mRNA表达5.MASH2基因仅MⅡ期卵母细胞、8细胞胚胎及囊胚中出现表达6.PEG10、ASB4基因在MⅡ期卵母细胞、4、8细胞胚胎及囊胚中有表达结论:1.国内首次证实与PWS相关的染色体15q11-13上父源性印迹基因SNRPN在卵母细胞GV、MⅠ、MⅡ期及植入前胚胎有表达,NDN表达于8细胞与囊胚及卵母细胞GV、MⅠ、MⅡ期,提示SNRPN、NDN促进卵母细胞成熟,早期胚胎生长发育。2.国内首次检测了与AS密切相关的染色体15q11-13上母源性印迹基因UBE3A表达于卵母细胞MⅠ、MⅡ期及植入前胚胎各期,提示其印迹状态受ART某些环节的干扰导致AS发病率增高提供理论依据。3.首次证实7号染色体父源表达的原癌基因PEG10表达于MⅡ期卵母细胞及4、8细胞与囊胚中,提示ART可能干扰其印迹状态,导致PEG10的活化,发生SRS。并督促我们必需长期随访ART出生人群,监测SRS及肿瘤的发生率。4.首次证实7号染色体上新近证实的父源印迹的基因ASB4表达于MⅡ期卵母细胞及除2细胞外的植入前胚胎。5.国内首次证实在11号染色体上母源表达、与胎盘发育有关的印迹基因MASH2在人类卵母细胞MⅡ期和8胚胎细胞阶段出现表达。6.证实了印迹基因表达在卵母细胞和胚胎的不同阶段,具有时间的特异性,提示各个基因组的印迹抹除、重建及维持也具有时间的特异性。7.单细胞巢式RT-PCR扩增成功率为81.0%(64/79),证实该技术准确性较高、稳定性较强,为进一步开展印迹疾病的PGD打下牢固基础。第二章印迹疾病PWS分子诊断的研究目的:旨在从染色体及基因水平对临床疑为PWS的患儿及其父母进行印迹基因SNRPN的检测,以作出PWS及其病因的确诊,为其父母再次生育提供理论依据,指导临床遗传咨询、治疗及产前诊断。方法:采用甲基化特异性PCR(methylation specific PCR,MS-PCR)技术研究染色体上15q11-13区与PWS密切相关的印迹基因SNRPN外显子alpha区上的19个CG位点的父母等位基因的甲基化状况。其作用原理基于DNA经亚硫酸氢钠修饰后,来自父方非甲基化序列的胞嘧啶(C)转变为尿嘧啶(U),而来自母方甲基化序列保持不变,随后用甲基化和非甲基化两对具有高度特异性的引物进行扩增,根据有无相应的特异产物对其病因做出诊断,并采用FISH技术从染色体水平上很直观的进一步精确确诊。结果:1.患儿MS-PCR结果:无父源非甲基化扩增条带,证实SNRPN基因外显子alpha区父源等位基因缺失或为母源单亲二倍体(maternal uniparentaldiplont,matUPD),确诊患儿为PWS。FISH结果:证实为15号染色体15q11-13片段SNRPN基因的微缺失。结合MS-PCR结果,该PWS患儿病因系15号父源染色体15q11-13片段SNRPN基因的微缺失,排除matUPD(15)。2.患儿父母与正常成人无异常。3.PCR产物测序结果证实SNRPN基因外显子alpha区扩增的基因片断存在19个甲基化位点(-CG-)。其母源为甲基化,父源为非甲基化。结论:1.FISH技术从染色体水平及MS-PCR技术从基因水平能对PWS等印迹疾病做出准确、快速的诊断,可作为印迹疾病确诊及产前印迹疾病筛查的常规技术。2.MS-PCR技术结合其PCR产物测序结果,可以了解某些基因CpG岛的甲基化状况,为在植入前胚胎逆转异常甲基化位点,阻断及治疗印迹疾病带来新的思路。