热休克蛋白90(Heat shock protein,Hsp90)是一种进化高度保守的分子伴侣,它能促进各种细胞信号通路中蛋白底物或客户蛋白的成熟,这对维持癌细胞的生长、侵袭、生存起着重要作用;相对应地,抑制Hsp90的活性也将导致致瘤性客户蛋白的降解。因此,Hsp90被认为是一种显著的肿瘤靶蛋白,而寻找Hsp90抑制剂也引起广泛关注。自17-丙烯胺格尔德霉素(17-Allylaminogeldanamycin,17-AAG)在1999年作为第一个进入临床试验的Hsp90抑制剂被发现以来,不同来源或不同设计结构的Hsp90抑制剂开始被引入到临床前和临床试验。迄今为止,有超过17种Hsp90抑制剂正在进行临床试验,但还没有作用于Hsp90的靶向抑制剂作为抗肿瘤药物上市。许多在研的Hsp90抑制剂均来源于中草药植物,显然,中草药凭借其广泛的研究和开发空间,始终是寻找和开发新型Hsp90抑制剂的研究热点,尤其具有抗肿瘤活性的中草药及新型的筛选技术有望成为研发Hsp90抑制剂的新的重要来源。雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook.F.),一种卫矛科植物雷公藤的干燥根及根茎,由于其丰富的生物活性成分,如生物碱类、二萜类、三萜类和倍半萜类等,被广泛用于类风湿关节炎和银屑病的临床治疗。然而,天然产物通常含有数百种甚至数千种浓度和性质不一的复杂成分,仅少数成分能体现其药理活性,且未曾有报道系统性地研究雷公藤中能够抑制Hsp90的生物活性成分。因此,为更高效且快速地发现天然产物中的活性成分,开发高通量、高选择性的筛选方法成为研究中的关键。传统的筛选技术集中于高通量筛选法与比色法或荧光微量检测法的结合,但该方法费时费力,显然不适用于复杂中草药提取物的研究。目前,凭借蛋白质靶点-配体直接结合的亲和型配体垂钓技术(Ligand Fishing),已被认为是最方便和有效的方法。该方法主要是靠固定靶蛋白于能够抵抗环境变化的固体表面,利用所得的固定相捕获不同混合溶液中潜在的活性化合物,因此,各种类型的固相载体得以被开发,如二氧化硅纳米球、磁性颗粒和纳米金粒子,应用于生物活性分子的研发。前期研究中,我们以一种Hsp90功能化的InP/ZnS量子点介孔荧光纳米微球作为荧光追踪剂及固相萃取剂,成功应用于中草药中(姜黄、泽泻提取物)Hsp90抑制剂、细胞提取物中Hsp90客户蛋白的筛选和鉴定。然而,InP/ZnS量子点分散于介孔纳米微球表面的结构缺陷,使其在光学成像的应用中仍面临一大隐患,一方面,这极易导致因镉的泄漏而引发的生物毒性,另一方面,当外部环境产生变化时,还容易导致因化学不稳定性而引发的荧光响应性波动。为解决上述问题,在本研究中,我们对前期开发的基于量子点介孔纳米微球靶向筛选方案进行了改造,试图构建一种新型“三明治式”微内核介孔复合纳米荧光探针(Microkernel-based mesoporous(SiO2-CdTe-SiO2)@SiO2 fluorescent nanoparticles,MMFNPs),有效保护量子点,从而解决不稳定性及生物毒性的问题,继而结合荧光成像、配体垂钓以及固相富集萃取等策略,应用于雷公藤中抗肿瘤Hsp90活性分子的筛选及鉴定,主要研究内容如下:1.构建靶蛋白功能化的微内核介孔复合纳米荧光探针;2.建立基于荧光成像与配体垂钓法相结合的分子伴侣Hsp90抑制剂筛选平台;3.针对筛选到的化合物进行抗肿瘤Hsp90活性验证。最终,我们制备得到一种颜色可调、高荧光、大比表面且多孔、高稳定性的功能化微内核介孔纳米复合荧光探针,并以此作为荧光追踪剂及固相萃取剂,开发了一种“荧光成像配体垂钓技术(Fluorescent Imaging Screening and Ligand Fishing)”,成功应用于雷公藤中Hsp90抑制剂的筛选和富集,不仅实现了实时荧光成像即时反映分子生物活性,而且排除了大量非活性物质的干扰,大大提高了对活性分子群的富集效率。结合质谱解析,识别与鉴定得到雷公藤中共十二种特异性组分,分别经虚拟对接筛选,最终验证发现三种与Hsp90有较强的特异性亲和力的潜在Hsp90抑制剂,即为雷公藤红素(Celastrol)、秋水仙胺(Demecolcine)以及雷公藤次碱(Wilforine)。抗肿瘤活性及体外抑制Hsp90作用的研究进一步验证了这三种特异性成分的抗肿瘤活性作用,为潜在Hsp90抑制剂的推断提供了有力佐证,同时为中草药中新型Hsp90抑制剂的发现与开发提供借鉴。