犬乳腺肿瘤差异环状RNA的筛选

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犬乳腺肿瘤在犬类中发病率高,是严重危害犬的身体健康的一种疾病。有研究表明,环状RNA(circRNA)与肿瘤的发生和发展有关,可作为肿瘤疾病相关的分子标志物。然而,circRNA在犬乳腺肿瘤中的表达谱尚不清楚。因此,本研究通过高通量测序技术探索了犬乳腺肿瘤中circRNA的表达谱,运用生物信息学分析,筛选出与犬乳腺肿瘤发生发展密切相关的差异基因,为今后深入研究犬乳腺肿瘤相关的基因或蛋白提供参考。在本研究中具体分析了3例犬乳腺肿瘤组织及其癌旁组织的表达谱,提取了总RNA并构建RNA文库。GO(Gene Ontology)和KEGG(Kyoto Genotypes and Genomes Encyclopedia)分析显示这些基因主要集中在14种生物途径上。本研究筛选了11个与犬乳腺肿瘤发生发展密切相关的circRNA,并通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法进一步证实了这些circRNA的存在,使用Cytoscape软件构建了circRNA-miRNA网络图,从而初步探究了犬乳腺肿瘤中circRNA的表达谱及相关差异基因的功能和参与的通路。本研究借助高通量测序技术在犬乳腺肿瘤及其癌旁组织中共检测到14851个circRNA,其中差异表达的(变化倍数(fold change)≥2.0,P值(P-value)≤0.05)有106个。这些差异环状RNA的来源基因的GO功能主要是调节分泌途径,调节神经递质分泌和吞噬作用,它们参与的通路中大多数与cGMP-PKG(环鸟苷单磷酸)信号传导途径,cAMP(环腺苷单磷酸)信号传导途径和OXYTOCIN信号传导途径有关。CircRNA具有吸附miRNA的“海绵体”功能,因此,本研究构建了circRNA和miRNA的相互作用网络。本研究筛选出与犬乳腺肿瘤密切相关基因的来源基因包括RYR2,PDE4D,ROCK2,CREB3L2和UBA3,与犬乳腺肿瘤有关的circRNA包括chr27:26618544-26687235-、chr26:8194880-8201833+、chr17:7960861-7967766-等。本研究对测序样品验证发现,高通量测序和低通量RT-qPCR这两种方法检测到的基因变化趋势是一致的,这证明了测序结果的高度可靠性;经过进一步扩大样本量检测发现,基因chr13-62685728-62729175+在临床样本中的表达均显著下调,表明基因chr13-62685728-62729175+对作为犬乳腺肿瘤的候选潜在生物标志物有一定的参考价值。在不同肿瘤细胞中,chr13-62685728-62729175+在细胞培养液中的表达量与在不同肿瘤细胞中的表达量呈正相关,提示chr13-62685728-62729175+是由肿瘤细胞释放到细胞培养液中。RNase R酶耐受性实验表明,circRNA相比线性RNA更不易被RNase R酶降解,表明circRNA具有良好的稳定性。组织特异性检测结果显示,chr13-62685728-62729175+和chr25-42146647-42163429-在犬的多种组织中有表达,特别富集在乳腺组织中。本研究首次对犬乳腺肿瘤中circRNA的表达谱进行了初步分析,筛选出了与犬乳腺肿瘤相关的并且显著差异表达的circRNA,为兽医临床进一步研究与犬乳腺肿瘤发病机制相关的关键circRNA提供了依据。
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