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犬冠状病毒(CCV)冠状病毒科,冠状病毒属Ⅰ群冠状病毒,有4种结构蛋白,分别是纤突(S)蛋白,膜(M)蛋白,核(N)蛋白及小膜(SM)蛋白。本研究应用单克隆抗体技术,分别制备了抗CCV单克隆抗体杂交瘤细胞株及抗CCV细胞受体的单克隆抗体杂交瘤细胞株,对CCV一些特性及病毒与细胞受体相互关系进行探讨,并建立了免疫过氧化物酶噬斑染色方法用于CCV感染的血清学诊断。 以纯化的犬冠状病毒(CCV)1-71株免疫BALB/C小鼠,取脾细胞和SP2/0细胞融合,用间接ELISA和中和试验(NT)筛选阳性克隆并用有限稀释法进行亚克隆。用A72细胞包被检测,剔除与细胞蛋白交叉反应阳性的克隆,得到5株杂交瘤细胞株,其中2株是只有ELISA值的单克隆抗体细胞株(E8和H6),3株既有ELISA值,又有中和性单克隆抗体细胞株(N9、A4和D5)。免疫转印结果显示:E8、H6识别蛋白大小为45kD,100kD及200kD左右。N9,A4和D5识别的蛋白条带分别在45kD,60kD和100kD及200kD左右,间接免疫荧光试验出现绿色荧光。 建立免疫过氧化物酶噬斑(IP)染色技术,用于犬冠状病毒感染诊断。通过中和试验(NT)与间接ELISA检测的阳性和阴性血清系列稀释加入IP检测系统,确定IP检测CCV血清抗体阴阳性临界值为血清40倍稀释,即IP>40为抗体阳性,IP<40为抗体阴性。并利用建立的IP试验对63份犬血清进行了检测。结果显示IP和NT检测健康犬血清20份结果一致,而腹泻犬的43份犬血清中,33份NT抗体阴性,10份阳性,28份IP试验抗体阴性,15份阳性,二者不相符者为5份(15.2%)。显示,IP检测CCV抗体较NT试验敏感。 犬冠状病毒通过和细胞受体结合而感染细胞。用犬纤维瘤细胞(A72)免疫Balb/c小鼠,通过阻断CCV感染细胞试验得到一株单抗R-H-2,免疫转印显示,在分子量为150kD左右有一条明显条带。阻断病毒感染的噬斑染色方法显示CCV1-71和TN 449感染A72细胞噬斑数明显减少,抑制率分别为98.8%和95.65%。