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目的：本研究以中医学“阴阳互济”理论为基础，以AMPK/mTOR信号通路为切入点，观察左、右归丸对去卵巢大鼠骨组织、骨髓基因及蛋白表达的影响，对PMOP骨代谢失衡进行解析，从骨吸收的角度寻找左、右归丸防治PMOP的实验依据。
材料与方法：2月龄无特定病原体(SPF)级体重为190-210g的雌性未生育SD大鼠，共60只，根据大鼠的体重采用分层随机分组法，将其分为空白组8只，假手术组8只，去卵巢组44只。模型组大鼠摘除两侧卵巢，假手术组大鼠摘除两侧卵巢组织周围等量体积的脂肪组织。造模7d后，将术后存活的44只大鼠按其体重分层随机分为6组，随机分为空白组即KB、假手术组即SHAM、模型组即OVX、雌二醇补佳乐组即BJL、右归丸组即YGW、左归丸组即ZGW。分组后开始灌胃给药治疗，按照每公斤大鼠6.3倍的剂量，将中药制成生药量为1g/ml水煎剂，把阳性对照药戊酸雌二醇(补佳乐)制成粉末，用蒸馏水制备为0.1mg/l的溶液。各治疗组灌服其对应的药物，KB组、SHAM组和OVX组均灌服2ml体积的蒸馏水，灌胃饲养期间，大鼠每月应称重1次，并根据体重重新计算其灌胃量。经过12w给药干预后，将灌胃死亡的大鼠除去，总共纳入48只大鼠。取材前大鼠需禁食，时长为24h，禁食期间饮水保持供应，末次给药后用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，应用数字化全身骨密度仪对各组大鼠腰椎进行在体骨密度测量；腹主动脉取血，室温静置2h后，低温冷冻离心机4℃，2000rpm*10min取上清液，于-80℃冰箱冻存。采用ELISA法测定血清PICP含量；取大鼠股骨，剔除附着的肌肉筋膜及结缔组织，放入4%多聚甲醛溶液中固定，之后进行脱钙3w，开始制作石蜡切片，用于骨组织形态学HE检测；取骨髓，取大鼠股骨并剪断两头，反复用PBS缓冲液冲洗髓腔，将骨干冲洗到发白透明。将骨髓放入离心管进行离心，弃掉上层PBS缓冲液，冻存于-80℃冰箱内。分别采用实时荧光定量PCR法检测大鼠骨组织和骨髓OPG、RANKL及骨组织中AMPKα1、mTORC1的基因表达情况；用蛋白印迹法检测大鼠骨组织和骨髓OPG、TRAR、RANKL及骨组织中AMPKα1、p-AMPKα1、mTORC1、p-mTORC1、TSC2、Rheb、p70s6k1、p-p70s6k1、4EBP1的蛋白表达情况。
结果：
1.左、右归丸对PMOP大鼠腰椎BMD的影响
与空白组相比，除假手术组外其余四组大鼠骨密度均下降，模型组骨密度明显下降(P＜0.01)，成功制备PMOP模型大鼠；与模型组相比，各治疗组骨密度均升高，具有统计学差异(P＜0.01)；与补佳乐组相比，左归丸组无显著性差异(P＞0.05)；右归丸组表达下降。左归丸组和补佳乐组治疗效果优于右归丸组(P＜0.05)，能有效预防卵巢切除引起的骨密度丢失。
2.左、右归丸对PMOP大鼠骨组织形态学的影响
研究结果表明，空白组和假手术组可见骨小梁排列紧密规则，拥有完整的形态结构，骨小梁之间呈网状连接，骨小梁表面能够见到多数单行排列整齐的成骨细胞，骨髓腔相对较小；模型组骨小梁总量显著减少，结构稀疏，连接性较差，呈不规则排列，出现大量骨小梁盲端并且小梁壁的厚度也不一致，骨小梁表面成骨细胞数目也显著减少，但发现大量体积大、形态不规则、多核的破骨细胞，骨髓腔增大；各治疗组经给药12w后，骨小梁数目均有不同程度的增加、骨小梁面积增大、增宽，结构排列形态与空白组较为接近，小梁间呈网状连接，骨髓腔缩小，其中补佳乐组、左归丸组效果明显。
3.左、右归丸对PMOP大鼠骨代谢指标的影响
与空白组相比，模型组PICP含量明显增加(P＜0.01)；与模型组相比，左归丸组、右归丸组、补佳乐组PICP均降低(P＜0.01或P＜0.05)；与补佳乐组相比，左归丸组疗效更好(P＜0.01)，更接近空白组和假手术组的表达水平，而右归丸组无显著性差异(P＞0.05)。
4.左、右归丸对PMOP大鼠骨吸收的影响
左、右归丸对PMOP大鼠骨、骨髓组织OPG、TRAP、RANKL的影响
基因检测结果显示：与空白组相比，模型组骨、骨髓组织OPG基因表达降低(P＜0.01)；与模型组相比，各治疗组OPG基因表达均有不同程度升高(P＜0.01)，左归丸组升高更为显著(P＜0.01)；与补佳乐组比较，左归丸组OPG基因表达升高(P＜0.01)，左归丸优于右归丸，并且优于其余治疗组。
与空白组相比，模型组RANKL基因表达上升(P＜0.01)；与模型组相比，各治疗组RANKL基因表达均有不同程度下降(P＜0.01或P＜0.05)；与补佳乐组比较，左归丸组RANKL基因表达下降(P＜0.01)；其中右归丸组RANKL基因表达升高(P＜0.05或P＜0.01)。
蛋白表达检测结果显示：与空白组比较，模型组骨、骨髓组织中的OPG蛋白表达水平降低显著(P＜0.01)；与模型组相比，各治疗组OPG蛋白表达均有不同程度升高，有统计学差异(P＜0.01)，与补佳乐组比较，各给药组OPG蛋白表达水平降低，左归丸组高于其他组。
与空白组相比，模型组RANKL蛋白表达上升(P＜0.01)；与模型组相比，各治疗组RANKL蛋白表达均有不同程度下降(P＜0.01或P＜0.05)；与补佳乐组比较，左归丸组RANKL蛋白表达下降(P＜0.01)，；其中右归丸组RANKL蛋白表达升高(P＜0.05或P＜0.01)。
与空白组相比，模型组TRAP蛋白表达上升(P＜0.01)；与模型组相比，各治疗组RANKL蛋白表达均有不同程度下降(P＜0.01)；与补佳乐组比较，左归丸组TRAP蛋白表达下降(P＜0.01)；其中右归丸组TRAP蛋白表达升高(P＜0.05或P＜0.01)。
5.左、右归丸对PMOP大鼠骨组织AMPK/mTOR信号通路的影响
基因检测结果表明：与空白组相比，模型组骨组织AMPK基因表达升高，具有显著性差异(P＜0.01)；与模型组相比，各给药组的AMPK基因的表达均显著降低(P＜0.01)；与补佳乐组相比，右归丸组AMPK基因表达上升(P＜0.01)。
与空白组比较，模型组骨组织mTOR基因的表达量降低，有显著性差异(P＜0.01)；与模型组比较，各给药组的mTOR基因的表达量均升高，有显著性差，具有统计学意义(P＜0.01)；与补佳乐组比较，左归丸组mTOR基因表达升高(P＜0.01)，YGW组表达下降(P＜0.01)。蛋白表达检测结果显示：与空白组比较，模型组骨组织磷酸化p-AMPKα1、TSC2蛋白表达升高，有显著性差异(P＜0.01)；与模型组比较，各给药组p-AMPKα1、TSC2蛋白均下降，有显著性差异(P＜0.01)；与补佳乐组比较，左归丸组低于补佳乐组，右归丸高于补佳乐组(P＜0.01)。
与空白组比较，模型组组骨组织磷酸化p-mTORC1、p-p70s6k1和Rheb蛋白表达下降，有显著性差异(P＜0.01)；与模型组比较，各给药组p-mTORC1、Rheb、p-p70s6k1
蛋白均升高，有显著性差异(P＜0.01)；与补佳乐组比较，左归丸组高于补佳乐组，右归丸低于补佳乐组(P＜0.01)。骨组织中4EBP1的蛋白各组之间没有显著性差异(P＞0.05)。
结论：
1大鼠去卵巢后，骨密度降低，骨微结构破坏，经过左、右归丸治疗后大鼠的骨密度升高；骨组织形态变化改善；显著抑制了骨吸收，有效防治绝经后骨质疏松症，其中左归丸疗效最佳。
2左、右归丸均可以调节PMOP大鼠骨、骨髓中的OPG、RANKL基因和蛋白以及TRAP的蛋白的表达水平，抑制破骨分化，其中左归丸的效果最为突出。
3左、右归丸均能够调节PMOP大鼠骨组织中AMPK/mTOR信号通路调控破骨分化。其中，左归丸组效果优于右归丸组。
材料与方法：2月龄无特定病原体(SPF)级体重为190-210g的雌性未生育SD大鼠，共60只，根据大鼠的体重采用分层随机分组法，将其分为空白组8只，假手术组8只，去卵巢组44只。模型组大鼠摘除两侧卵巢，假手术组大鼠摘除两侧卵巢组织周围等量体积的脂肪组织。造模7d后，将术后存活的44只大鼠按其体重分层随机分为6组，随机分为空白组即KB、假手术组即SHAM、模型组即OVX、雌二醇补佳乐组即BJL、右归丸组即YGW、左归丸组即ZGW。分组后开始灌胃给药治疗，按照每公斤大鼠6.3倍的剂量，将中药制成生药量为1g/ml水煎剂，把阳性对照药戊酸雌二醇(补佳乐)制成粉末，用蒸馏水制备为0.1mg/l的溶液。各治疗组灌服其对应的药物，KB组、SHAM组和OVX组均灌服2ml体积的蒸馏水，灌胃饲养期间，大鼠每月应称重1次，并根据体重重新计算其灌胃量。经过12w给药干预后，将灌胃死亡的大鼠除去，总共纳入48只大鼠。取材前大鼠需禁食，时长为24h，禁食期间饮水保持供应，末次给药后用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，应用数字化全身骨密度仪对各组大鼠腰椎进行在体骨密度测量；腹主动脉取血，室温静置2h后，低温冷冻离心机4℃，2000rpm*10min取上清液，于-80℃冰箱冻存。采用ELISA法测定血清PICP含量；取大鼠股骨，剔除附着的肌肉筋膜及结缔组织，放入4%多聚甲醛溶液中固定，之后进行脱钙3w，开始制作石蜡切片，用于骨组织形态学HE检测；取骨髓，取大鼠股骨并剪断两头，反复用PBS缓冲液冲洗髓腔，将骨干冲洗到发白透明。将骨髓放入离心管进行离心，弃掉上层PBS缓冲液，冻存于-80℃冰箱内。分别采用实时荧光定量PCR法检测大鼠骨组织和骨髓OPG、RANKL及骨组织中AMPKα1、mTORC1的基因表达情况；用蛋白印迹法检测大鼠骨组织和骨髓OPG、TRAR、RANKL及骨组织中AMPKα1、p-AMPKα1、mTORC1、p-mTORC1、TSC2、Rheb、p70s6k1、p-p70s6k1、4EBP1的蛋白表达情况。
结果：
1.左、右归丸对PMOP大鼠腰椎BMD的影响
与空白组相比，除假手术组外其余四组大鼠骨密度均下降，模型组骨密度明显下降(P＜0.01)，成功制备PMOP模型大鼠；与模型组相比，各治疗组骨密度均升高，具有统计学差异(P＜0.01)；与补佳乐组相比，左归丸组无显著性差异(P＞0.05)；右归丸组表达下降。左归丸组和补佳乐组治疗效果优于右归丸组(P＜0.05)，能有效预防卵巢切除引起的骨密度丢失。
2.左、右归丸对PMOP大鼠骨组织形态学的影响
研究结果表明，空白组和假手术组可见骨小梁排列紧密规则，拥有完整的形态结构，骨小梁之间呈网状连接，骨小梁表面能够见到多数单行排列整齐的成骨细胞，骨髓腔相对较小；模型组骨小梁总量显著减少，结构稀疏，连接性较差，呈不规则排列，出现大量骨小梁盲端并且小梁壁的厚度也不一致，骨小梁表面成骨细胞数目也显著减少，但发现大量体积大、形态不规则、多核的破骨细胞，骨髓腔增大；各治疗组经给药12w后，骨小梁数目均有不同程度的增加、骨小梁面积增大、增宽，结构排列形态与空白组较为接近，小梁间呈网状连接，骨髓腔缩小，其中补佳乐组、左归丸组效果明显。
3.左、右归丸对PMOP大鼠骨代谢指标的影响
与空白组相比，模型组PICP含量明显增加(P＜0.01)；与模型组相比，左归丸组、右归丸组、补佳乐组PICP均降低(P＜0.01或P＜0.05)；与补佳乐组相比，左归丸组疗效更好(P＜0.01)，更接近空白组和假手术组的表达水平，而右归丸组无显著性差异(P＞0.05)。
4.左、右归丸对PMOP大鼠骨吸收的影响
左、右归丸对PMOP大鼠骨、骨髓组织OPG、TRAP、RANKL的影响
基因检测结果显示：与空白组相比，模型组骨、骨髓组织OPG基因表达降低(P＜0.01)；与模型组相比，各治疗组OPG基因表达均有不同程度升高(P＜0.01)，左归丸组升高更为显著(P＜0.01)；与补佳乐组比较，左归丸组OPG基因表达升高(P＜0.01)，左归丸优于右归丸，并且优于其余治疗组。
与空白组相比，模型组RANKL基因表达上升(P＜0.01)；与模型组相比，各治疗组RANKL基因表达均有不同程度下降(P＜0.01或P＜0.05)；与补佳乐组比较，左归丸组RANKL基因表达下降(P＜0.01)；其中右归丸组RANKL基因表达升高(P＜0.05或P＜0.01)。
蛋白表达检测结果显示：与空白组比较，模型组骨、骨髓组织中的OPG蛋白表达水平降低显著(P＜0.01)；与模型组相比，各治疗组OPG蛋白表达均有不同程度升高，有统计学差异(P＜0.01)，与补佳乐组比较，各给药组OPG蛋白表达水平降低，左归丸组高于其他组。
与空白组相比，模型组RANKL蛋白表达上升(P＜0.01)；与模型组相比，各治疗组RANKL蛋白表达均有不同程度下降(P＜0.01或P＜0.05)；与补佳乐组比较，左归丸组RANKL蛋白表达下降(P＜0.01)，；其中右归丸组RANKL蛋白表达升高(P＜0.05或P＜0.01)。
与空白组相比，模型组TRAP蛋白表达上升(P＜0.01)；与模型组相比，各治疗组RANKL蛋白表达均有不同程度下降(P＜0.01)；与补佳乐组比较，左归丸组TRAP蛋白表达下降(P＜0.01)；其中右归丸组TRAP蛋白表达升高(P＜0.05或P＜0.01)。
5.左、右归丸对PMOP大鼠骨组织AMPK/mTOR信号通路的影响
基因检测结果表明：与空白组相比，模型组骨组织AMPK基因表达升高，具有显著性差异(P＜0.01)；与模型组相比，各给药组的AMPK基因的表达均显著降低(P＜0.01)；与补佳乐组相比，右归丸组AMPK基因表达上升(P＜0.01)。
与空白组比较，模型组骨组织mTOR基因的表达量降低，有显著性差异(P＜0.01)；与模型组比较，各给药组的mTOR基因的表达量均升高，有显著性差，具有统计学意义(P＜0.01)；与补佳乐组比较，左归丸组mTOR基因表达升高(P＜0.01)，YGW组表达下降(P＜0.01)。蛋白表达检测结果显示：与空白组比较，模型组骨组织磷酸化p-AMPKα1、TSC2蛋白表达升高，有显著性差异(P＜0.01)；与模型组比较，各给药组p-AMPKα1、TSC2蛋白均下降，有显著性差异(P＜0.01)；与补佳乐组比较，左归丸组低于补佳乐组，右归丸高于补佳乐组(P＜0.01)。
与空白组比较，模型组组骨组织磷酸化p-mTORC1、p-p70s6k1和Rheb蛋白表达下降，有显著性差异(P＜0.01)；与模型组比较，各给药组p-mTORC1、Rheb、p-p70s6k1
蛋白均升高，有显著性差异(P＜0.01)；与补佳乐组比较，左归丸组高于补佳乐组，右归丸低于补佳乐组(P＜0.01)。骨组织中4EBP1的蛋白各组之间没有显著性差异(P＞0.05)。
结论：
1大鼠去卵巢后，骨密度降低，骨微结构破坏，经过左、右归丸治疗后大鼠的骨密度升高；骨组织形态变化改善；显著抑制了骨吸收，有效防治绝经后骨质疏松症，其中左归丸疗效最佳。
2左、右归丸均可以调节PMOP大鼠骨、骨髓中的OPG、RANKL基因和蛋白以及TRAP的蛋白的表达水平，抑制破骨分化，其中左归丸的效果最为突出。
3左、右归丸均能够调节PMOP大鼠骨组织中AMPK/mTOR信号通路调控破骨分化。其中，左归丸组效果优于右归丸组。