一、PD-L1和HBx双靶向沉默IhRNA载体的构建及其抗HBV感染HCC的作用研究研究背景肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是常见的和预后较差的恶性肿瘤之一,其发病率和致死率分别居恶性肿瘤的第五位和第三位。肝癌的发生发展是一个多步骤、多阶段的病理学过程,其发生发展经历了肝炎-肝硬化-肝癌“三部曲”的演变过程。导致肝癌发生的因素有多种,其中由HBV引起的肝癌就能占到一半以上,全世界已经有超过2.4亿HBV慢性感染者,每年死于HBV慢性感染疾病的人数高达70万。遗憾的是,迄今为止,临床仍旧缺乏安全、特异性抑制慢性HBV感染及肝纤维化的有效治疗策略。X基因区是HBV十分重要的反式激活因子,在HBV的生命周期中发挥着关键作用,并可以通过影响宿主细胞的表观遗传学、非编码RNA的表达及胞内各种信号通路转导,促进肝癌的发生发展。另外,X基因序列区域保守,突变率极低,是抗HBV治疗的理想靶点。近年来研究发现,参与机体免疫调节的协同刺激分子PD-L1在宿主细胞的异常表达在HBV的免疫逃逸中扮演着重要角色。PD-L1可抑制HBV慢性感染(CHB)患者体内CD8+T细胞的抗病毒能力,诱导其发生凋亡,从而引起T细胞的耗竭状态。鉴于上述研究,结合HBV本身和宿主免疫应答的特征,我们拟利用RNA干扰技术针对HBx和PD-L1两个靶点分子构建双靶向沉默长发卡RNA(long haipin RNA,lhRNA)载体,通过体内外实验探讨该双靶向沉默载体的治疗效果及其相关机制。研究方法1.设计并合成PD-L1 siRNA序列,qPCR筛选沉默效果较好的siRNA序列;合成HBx siRNA序列,qPCR和Western Blot鉴定其沉默效果;2.设计并合成PD-L1和HBx的长发卡RNA序列,退火,经与酶切载体连接,转化及测序等步骤,构建双沉默lhRNA载体lhRNA-HBx/PD-L1:3.以携带HBV全基因组的HepG2.2.15细胞为研究对象,流式细胞术检测其PD-L1的表达,并用双沉默载体lhRNA-HBx/PD-L1进行转染,通过qPCR、Western Blot和流式细胞术等方法检测lhRNA-HBx/PD-L1对PD-L1和HBx的沉默效果;4.用双沉默载体lhRNA-HBx/PD-L1转染HepG2.2.15细胞6h后,将转染细胞以6000个细胞/孔重新接入96孔板,培养72h,CCK-8实验检测细胞的增殖能力;5.用双沉默载体lhRNA-HBx/PD-L1转染HepG2.2.15细胞24h后,利用流式细胞术,分别通过Annexin V/PI染色和PI染色等技术检测细胞凋亡和周期的变化;6.用双沉默载体lhRNA-HBx/PD-L1转染HepG2.2.15细胞48h后,通过Western-blot等方法检测BCL-2,BCL-XL等抗凋亡相关分子的表达以及mTOR信号通路中mTOR蛋白活化水平;7.用双沉默载体lhRNA-HBx/PD-L 1转染HepG2.2.15细胞24h后,通过qPCR等方法检测BCL-2、BCL-XL等抗凋亡相关分子以及mTOR信号通路中RHEB和TSC-1等分子的mRNA水平;8.利用CCK-8实验检测沉默HepG2.2.15细胞PD-L1和HBx后,其对CHB hPBMC的杀伤敏感性增强;9.lhRNA-HBx/PD-L1转染HepG2.2.15细胞,然后与CHB hPBMC共孵育,流式细胞术分析其对hPBMC中CD8+T和NK细胞的活化、功能的影响;10.qPCR、ELASA方法检测沉默PD-L1和HBx后,HepG2.2.15细胞分泌的细胞因子谱发生变化。研究结果1.PD-L1 siRNA序列的筛选及HBx siRNA的沉默效果鉴定利用lipofectamineTM 2000将设计的三条PD-L1 siRNA分别转染入U251细胞中,24h后,定量PCR检测PD-L1基因表达,成功筛选沉默效果达到72.75±6.6%的序列siRNAl;我们还根据前期研究合成了靶向于HBx的siRNA序列,经过定量PCR和Western Blot检测,均证明该序列具有良好的沉默效果(67.33±10.5%)。2.PD-L1和HBx基因双靶向沉默lhRNA载体构建经测序验证,成功构建了一种能同时靶向沉默PD-L1和HBx的长发卡RNA(lhRNA)载体lhRNA-HBx/PD-L1,转染HepG2.2.15细胞后,HBx和PD-L1在基因和蛋白水平均能明显下调。3。双靶向沉默lhRNA能抑制HepG2.2.15细胞的生长双沉默载体lhRNA-HBx/PD-L1转染HepG2.2.15细胞以后,细胞增殖受到抑制,细胞凋亡明显增加;细胞周期受到轻微阻滞,抗凋亡相关分子Bcl-2和Bcl-xl在蛋白和基因表达水平均明显下调,且能抑制细胞增殖生长相关的mTOR信号通路的活化。4.双靶向沉默lhRNA能增加HepG2.2.15细胞对hPBMC的杀伤敏感性利用lhRNA-HBx/PD-L1沉默HepG2.2.15细胞PD-L1和HBx后,其对PBMCs的杀伤敏感性显著增加。5.双靶向沉默lhRNA能逆转HepG2.2.15细胞对hPBMC中CD8+T和NK细胞功能的抑制作用lhRNA-HBx/PD-Ll 沉默 HepG2.2.15 细胞肿瘤细胞 PD-L1 和 HBx 后,PBMC 中 CD8+T和NK细胞杀伤相关分子表达升高,增强其杀伤功能。结论及意义:1.成功构建了能同时沉默PD-L1和HBx的双靶向沉默lhRNA载体lhRNA-HBx/PD-L1;2.lhRNA-HBx/PD-L1载体能明显抑制HepG2.2.15细胞的增殖,诱导细胞凋亡,阻滞周期发展,并能抑制细胞生长相关的mTOR信号通路的活化;3.lhRNA-HBx/PD-L1载体能增加HepG2.2.15细胞对hPBMC的杀伤敏感性,且可逆转HepG2.2.15细胞对CHB hPBMC中CD8+T和NK细胞功能的抑制作用;4.该研究为临床有效治疗CHB以及HBV相关HCC提供了新的思路和策略。二、依达拉奉对肝纤维化发生发展的影响及机制研究研究背景肝纤维化(liver fibrosis)是由多种致病因素引起的慢性肝损害所致的可逆的损伤修复的病理过程。而神经外科重症病人,由于病情重、处于昏迷状态或药物深镇静,常合并肺部感染等并发症,需较长时程应用药物进行治疗。在中国,由于HBV等病毒的合并感染,长时程药物使用极易对这些病人造成危害,易于出现药物诱导性肝纤维化。依达拉奉为神经科临床常用长时程应用药物,是一种很强抗氧化剂,其可通过减轻氧化损伤,保护细胞和神经功能,进而减轻脑水肿并发挥抗炎作用。因此,阐明依达拉奉对药物性肝纤维化的作用及其机制具有重大意义。我们拟利用分子生物、细胞生物学等技术,体内外实验探讨依达拉奉在肝纤维化发生发展过程中的作用及其机制。研究方法1.应用硫代乙酰胺(TAA)腹腔注射法建立小鼠肝纤维化模型;2.应用免疫组织化学方法、天狼猩红染色法、H&E、Western Blot、qPCR、ALT及AST等方法检测依达拉奉对TAA造模小鼠肝脏胶原沉积、HSCs活化、炎性细胞浸润及肝细胞损伤程度的影响,以评价依达拉奉对纤维化进程的调控作用。3.流式细胞术检测小鼠肝内淋巴细胞、单核细胞及中性粒细胞的比例变化;4.流式细胞术、免疫组织化学方法及PT-PCR法检测小鼠肝脏组织中单核巨噬细胞比例变化;5.qPCR、ELISA和Western Blot方法检测肝脏组织中炎症细胞因子表达水平;6.腹腔提取小鼠原代单核巨噬细胞或PMA刺激得到人源THP-1分化的单核巨噬细胞,体外用LPS刺激建立炎症模型,qPCR、ELISA或Western Blot等方法检测单核巨噬细胞IL-1β基因和蛋白水平;流式细胞术检测细胞ROS的产生水平,Western Blot检测NF-κB和AP-1蛋白的活化水平,探讨依达拉奉抑制单核巨噬细胞IL-1 β分泌的机制;7.肝脏原位灌流及Opti-Prep密度梯度离心分离野生型C57BL/6小鼠HSCs,体外培养5天,采用单核巨噬细胞培养上清孵育HSCs,细胞免疫荧光双染法和qPCR方法检测其肝纤维化相关分子的蛋白和基因表达水平,评判条件培养上清对HSCs活化的影响;体外实验利用Western Blot实验探讨依达拉奉对人源单核细胞THP-1和人源肝星状细胞系LX-2的相互作用;进一步用IL-1β细胞因子刺激LX2细胞,Western Blot方法检测其肝纤维化相关分子的蛋白表达水平,以证明单核巨噬细胞分泌的IL-1 β在肝星状细胞活化中的作用。研究结果1.依达拉奉能够减弱TAA诱导的肝纤维化程度通过腹腔注射给药方式,对纤维化模型小鼠进行依达拉奉给药治疗,结果显示,与纤维化模型组相比,依达拉奉给药组α-SMA、collagen I的表达水平均降低,提示依达拉奉可以明显抑制纤维化肝脏胶原沉积和HSCs活化,抑制肝纤维化疾病进程。2.依达拉奉对TAA引起的肝损伤有一定的保护作用对肝脏组织HE染色及小鼠血清中ALT和AST检测发现,与纤维化模型组相比,依达拉奉给药组的炎性细胞浸润及肝损伤均有一定程度减轻,并且肝脏组织中与凋亡相关的分子caspase3和FADD的蛋白与基因表达明显受到抑制,说明依达拉奉对TAA引起的肝损伤有一定的保护作用。3.依达拉奉抑制单核巨噬细胞向肝脏中募集并抑制其炎症因子分泌免疫组化染色、流式细胞术及qPCR结果显示,与纤维化模型组相比,依达拉奉能抑制单核巨噬细胞向肝脏中募集qPCR,肝脏组织中炎症因子IL-1 β的mRNA水平和蛋白水平均收到抑制。4.依达拉奉通过清除ROS和抑制NF-κB的活化抑制单核巨噬细胞IL-1 β的分泌腹腔提取单核巨噬原代细胞,LPS刺激建立体外炎症模型,通过qPCR、ELISA和Western Blot等体外实验发现,依达拉奉能抑制LPS引起的IL-1 β的基因和蛋白表达,并通过清除炎症应答过程中ROS的产生,抑制NF-κB蛋白的活化水平,进而抑制IL-1 β的表达。5.依达拉奉通过抑制单核巨噬细胞IL-1β的分泌抑制肝星状细胞的活化应用肝脏原位灌流及密度梯度法分离小鼠原代HSCs,体外培养5天,收集LPS刺激及依达拉奉给药组的巨噬细胞的条件培养上清,与HSCs共孵育,通过细胞免疫荧光双染法和qPCR方法检测发现,与LPS单独刺激组的培养上清孵育的HSCs相比,依达拉奉给药组HSCs中与肝纤维化相关的分子(Collagen Ⅰ和α-SMA分子)的蛋白和基因水平均受到显著抑制;进一步,我们观察到,LPS刺激的THP-1细胞条件培养上清可以引起LX2细胞活化分子α-SMA的上调,而依达拉奉能抑制该作用,但是依达拉奉不对LX-2细胞的肝纤维特性产生直接的作用。通过体外外加IL-1β细胞因子实验检测发现这种抑制现象消失,说明依达拉奉是通过抑制单核巨噬细胞IL-1β的分泌抑制肝星状细胞的活化。结论及意义1.体内实验证明依达拉奉能通过抑制单核巨噬细胞向肝脏的募集及其促炎因子的分泌减轻TAA引起的肝脏损伤,进而抑制肝纤维的发展进程;2.体外实验证明,依达拉奉能通过清除单核巨噬细胞炎症过程中产生的过量ROS,抑制NF-κB信号通路的活化,进而抑制促纤维因子IL-1β的分泌,间接地抑制肝星状细胞的活化。3.这些结果提示我们,依达拉奉长期治疗神经外科重症病人时,不会引起药物诱导性肝纤维化,且神经外科病人伴随有慢性肝炎时,可能与肝病治疗药物有协同治疗效果。因此,该研究对药物性肝纤维化作用、减轻肝脏损害及节省医疗资源具有重大指导意义。