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金属硫蛋白(Metallothionein，MT)自发现以来，大量实验显示其在清除体自由基内、解除重金属的毒性、增强机体对各种不良状态的适应能力、贮存锌元素、防止细胞癌变等方面发挥着重要的作用，因而使之可能成为重要的潜在的医药蛋白资源。而现有金属硫蛋白的来源主要是动物内脏提取物，虽然来源方便但存在重金属污染，不适合用于医药行业，而且不适合大规模的产品开发。本研究拟采用基因重组技术克隆中华绒螯蟹的MT基因，建立该蛋白的体外原核表达系统，诱导其大量表达并获得高纯度无有害内源毒素的金属硫蛋白产物，并初步观察其在烫伤治疗中的作用。
材料与方法
1.重组质粒pET-GST-MT的构建、表达及重组蛋白的纯化
1.1选用包括分泌型(pLLP-OmpA、pLLP-STII)、引导分泌型(pMBP-P)、胞内直接表达型(pMBP-C、pET-GST、pET-His)、分子内伴侣协助折叠型(pET-DsbA)、高度稳定伴侣型(PET-Trx、pET-CKS)等类型的原核表达载体，作为初步实验表达筛选对象，确定合适的载体；目的基因是本实验室已克隆并鉴定的中华绒螯蟹cDNA。通过设计含有酶切位点的PCR引物扩增编码区片段，首先克隆于T-载体中，然后利用导入的酶切位点，连接到以上载体系列中。各连接产物转化大肠杆菌Top10，根据金属硫蛋白的特性，转化时在培养基中加入不同浓度的Zn、Cu离子得出成功转化的培养条件，以补充重组蛋白结合金属离子导致的细胞代谢酶类所含必需金属元素的缺乏。对获得的阳性菌落提取质粒，行PCR、限制性内切酶酶切鉴定，初步判断正确的重组子测序鉴定。
1.2测序结果无误后将重组质粒pET-GST-MT转入BL21，获得了基因工程菌株，优化常规影响基因工程菌表达的条件。首先设定了25℃、30℃、37℃培养温度；上述培养条件不变，设立IPTG的浓度分别为0.5mmol/L、1mmol/L、2mmol/L、3mmol/L诱导时间为分别为2、3、4、5小时诱导重组蛋白表达；上述培养条件不变，设立葡萄糖的浓度分别0.5％、1％、2％、3％诱导融合蛋白表达；根据MT螯合金属的特性，选用了不同浓度的Zn+2、Cu+2、Mo+2、Mn+2离子作为添加剂诱导融合蛋白的表达。Zn+2离子浓度分别为10μmol/L，30μmol/L，50μmol/L，100μmol/L；Cu+2的浓度为10μmol/L，50μmol/L，100μmol/L，150μmol/L；Mo+2的浓度为50μmol/L，100μmol/L，150μmol/L，300μmol/L；Mn+2的浓度为50μmol/L，100μmol/L，150μmol/L，300μmol/L；在实验室水平小量培养得出最佳的表达条件。在此基础上扩大培养，诱导金属硫蛋白在大肠杆菌中大量表达。
1.3利用融合蛋白上的6His能与多种过渡金属鳌合物结合的等性。采用Ni-SuperChelatingResin亲合层析按照层析说明常规洗脱融合蛋白；利用MT鳌合金属离子的特性利用Zn-SuperChelatingResin亲合层析并采用0～2mol/L咪唑洗脱表达的融合蛋白。利用融合蛋白前端的GST与谷胱甘肽S-转移酶结合的特性采用GlutathionSepharose4B亲和层析柱常规洗脱目的蛋白。纯化得到融合蛋白。用P3C蛋白酶酶切GST标签。得到金属硫蛋白单体，BCA法测定纯化蛋白的含量。
2.MT在鼠、兔烫伤治疗中的应用
2.1建立深二度烧伤的动物模型，观察MT在烫伤炎症反应中的作用。
2.1.1四十只Wistar雄性大鼠，体重约300g随机分四组，每组十只，A：空白对照组；B：MT溶解缓冲液对照组；C：MT处理烧伤创口组；D：MT-GST溶合蛋白处理烧伤创口组；
2.1.2四十只新西兰白兔(体重2000±200g)随机分四组，每组二十只，A：空白对照组；B：MT溶解缓冲液对照组；C：MT处理烧伤创口组；D：MT-GST融合蛋白处理烧伤创口组；
2.2观察下列指标：
2.2.1耳缘静脉取周围血作血常规：监测血中中性粒细胞的变化(烧伤的第一天、第三天、第五天、第七天)；
2.2.2检测血中的SOD、CAT、MDA水平(烧伤的第一天、第三天、第五天、第七天)；
2.2.3烧伤后第三天作病理切片HE染色；
2.2.4每天拍照记录创面变化。
结果:
1.分泌型(pLLP-OmpA、pLLP-STII)、引导分泌型(pMBP-P)、胞内直接表达型(pMBP-C、pET-GST、pET-His)、分子内伴侣协助折叠型(pET-DsbA)、高度稳定伴侣型(PET-Trx、pET-CKS)等类型的原核表达载体与MT基因连接转入大肠杆菌，只有连接M基因的pET-GST胞内直接表达型载体在含10μmol/LZnCl2LB的平板上有菌落生长，行酶切、PCR鉴定正确后测序。测序结果显示连接准确无读码框移位；
2.收集诱导的菌液行SDS-PAGE电泳分析。出现明显的区带且分子量经初步分析与预计目的蛋白的分子量大小一致。以鼠抗6His为一抗行Westernblot鉴定，结果显示样品离心后的上清和沉淀在33KD处均有特异条带，与GST-MT融合蛋白分子量符合，说明pET-GST-MT所编码的重组蛋白编码正确、无移码、并且表达的蛋白有可溶和包涵体两种形式。
3.优化了常规影响基因工程菌的表达条件。证明如下筛选条件1mmol/LIPTG、30μmol/LZnCl2、2％葡萄糖、37℃诱导3个小时重组蛋白的表达量最高；根据MT螯合金属的特性，选用了不同浓度的Zn+2、Cu+2、Mo+2、Mn+2离子作为添加剂诱导融合蛋白的表达。表达量最高时离子浓度分别为：Zn+2浓度为30μmol/L、Cu+2浓度为100μmol/L、Mo+2浓度为150μmol/L、Mo+。离子浓度为100μmol/L，上述离子中以30μmol/LZn+2的诱导表达量最高；由此确定如下优化表达条件：1mmol/LIPTG、30μmol/LZnCl2、2％葡萄糖LB培养基，37℃诱导3个小时。
4.在选用Ni-SuperChelatingResin亲合层析时采用常规低浓度咪唑洗脱，对照蛋白可以洗脱完全，而融合蛋白只有在咪唑浓度提高三倍后才可以洗脱下来。上述结果证明了金属硫蛋白强螯合金属的特性，从而说明上述纯化原理是利用了MT而非6His和填料上的Ni结合。这样获得的融合蛋白含有重金属Ni而限制了其应用。因此本研究选用对人体有益的微量元素Zn作为配基进行纯化。获得了含锌的融合蛋白。行P3C酶切，酶切回收率为80％。继而行GlutathionSepharose4B亲和层析得到MT单体，其中过柱得率为75％，1L菌液可得6g湿菌。最终可获得单体蛋白0.002g。经BCA测定：纯化产物纯度大于90％，可用于下一步的功能研究。
5.通过病理切片HE染色结果证实动物模型建立正确，两种动物实验显示：MT和GST-MT治疗组较之MT溶解缓冲液对照组相比，创面红肿轻、炎症期渗出液少、创面较干燥。根据实验结果可初步分析说明MT和GST-MT对烫伤的动物有减轻炎症反应，但局部用药后机体内的氧化产物无变化。
结论:
1.亚克隆构建了原核表达体系pET-GST-MT重组质粒，获得了金属硫蛋的基因工程菌株；通过体外诱导重组质粒表达制备融合蛋白，改进并简化了MT的纯化工艺，获得了MT的融合蛋白和金属硫蛋白单体。
2.动物实验证明了金属硫蛋白的特性。通过其抑制烫伤炎症反应促进伤口愈合的作用。推测MT具有抗氧化的作用。