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DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase,dnmt)基因主要参与DNA甲基化过程(在基因组 DNA 胞嘧啶上添加甲基基团的过程),其中DNMT1 在成人细胞基因组 DNA 甲基化维护中有着举足轻重的作用。正常组织细胞中,广泛表达的基因启动子区域 CpG 岛常处于非甲基化状态;肿瘤细胞中,这些 CpG 岛常变为甲基化状态,其相关基因的表达亦被关闭。这一观点在对许多基因的研究中也得到了证实,如:肿瘤抑制基因、细胞周期凋亡调节基因、DNA 修复基因、激素受体基因和抑制血管形成基因等。由此可见,DNA 甲基化和肿瘤形成有着密不可分得关系。 RNA 干扰(RNA interfering,RNAi)技术是最近广泛用于抑制基因表达的新技术,主要用于基因功能和基因治疗学等方面的研究。本课题应用 RNAi 技术,研究在人胃癌细胞株 AGS 中转染靶向 dnmt1 基因的 RNAi 重组体后 dnmt1 基因转录水平和 DNMT1 蛋白表达的变化;观察 shRNA 作用后,对 AGS 细胞增殖凋亡的影响;并初步研究其对胃癌裸鼠模型的治疗效果,从而为肿瘤的临床基因治疗在细胞水平、分子水平、整体水平上提供新的理论基础。 目的:利用RNAi技术,构建靶向dnmt1基因的短发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA)重组质粒,观察其在胃癌 AGS 细胞中抑制 dnmt1基因的表达作用,为进一步研究其对胃癌基因治疗效果打下基础。 方法:设计、合成含 dnmt1 编码基因片段的 siRNA,与转录载体pTZU6+1 连接,构建 pshRNA-dnmt1 重组质粒;转染胃癌细胞株 AGS,用 RT-PCR 法和 Western Blot 法分别检测其对 dnmt1 基因 mRNA 转录水平和蛋白表达水平的影响。 结果:成功地构建靶向 dnmt1 基因的 shRNA 重组质粒pshRNA-dnmt1,并经序列分析得到确证。Western blot 检测结果表明用pshRNA-dnmt1 转染 AGS 细胞后 24h 开始出现 DNMT1 蛋白表达量减少(抑制率为 28.24%);48h 已经比较明显(68.54%);72h 作用最强(81.47%)。RT-PCR检测结果证实重组质粒pshRNA-dnmt1对胃癌AGS细胞中 dnmt1 基因的转录有着明显抑制作用,转染后 24h 抑制率在 73%左右;48h 为 52.97%;72h 为 72.06%。 结论:构建的 pshRNA-dnmt1 重组质粒能有效地抑制 dnmt1 基因在胃癌 AGS 细胞中的表达。