研究背景:肠道缺血再灌注(Intestinalischemia-reperfusion，I/R)是出血性休克、严重烧伤、严重创伤、器官移植和外科急危重病等临床常见的病理生理过程。肠道缺血再灌注损伤可引起肠粘膜结构的破坏，包括肠屏障功能不全和衰竭，导致肠道粘膜通透性增加，肠腔内细菌及有毒代谢产物如内毒素等进入宿主血液循环，刺激机体免疫细胞和补体系统产生大量炎症介质和细胞因子，对全身各器官(包括内脏器官)造成严重损害及导致内脏器官内源性生长因子发生继发性的变化，炎症介质和细胞因子还可诱发全身性炎症反应综合征(systemicinflammatoryresponsesyndrome，SIRS)，进一步发展可导致多器官功能不全综合征(multipleorgandysfunctionsyndrome，MODS)，严重时甚至产生多器官功能衰竭(multipleorganfailure，MOF)。 近年来对严重创伤和烧伤后造成的内脏器官损害及损伤后的修复研究在外科创伤领域已引起广泛关注，其中生长因子和肠道器官修复关系的研究是一个新的焦点，尤其是生长因子对内脏器官细胞增殖和分化的调节作用特别引人瞩目。已有研究发现，肠道缺血再灌注损伤可引起包括肠道在内的多个脏器内源性成纤维细胞生长因子(Fibroblastgrowthfactor，FGF)发生变化，主要是酸性成纤维细胞生长因子(Acidicfibroblastgrowthfactor，aFGF)和碱性成纤维细胞生长因子(Basicfibroblastgrowthfactor，bFGF)这两大类生长因子的含量减少，而在肠道缺血再灌注损伤后静脉内补充外源性的FGF可以促进胃肠道、肺、肾和其他内脏器官的结构和功能的恢复。但目前对成纤维细胞生长因子调控肠道损伤后上皮细胞增殖、分化和凋亡的分子机制我们知之甚少。 FGF在许多正常成熟组织均有表达，对各种间叶细胞、神经细胞、上皮细胞有促有丝分裂活性，在正常的胚胎发育、血管发生、创伤修复中起调节作用。在体外细胞培养研究中，它也可以调节肠上皮细胞的增殖、分化和移行。新近的研究说明，FGF可通过激活丝裂原活化蛋白质激酶(mitogen-activatedproteinkinase，MAPK)信号通路来传递促进肠上皮细胞增殖信号，其中p44/42MAPK(ERKl/2)活性对细胞周期的进程和肠上皮细胞分化两者都是必需的。在许多其他类型的细胞中，生长因子也可以通过MAPK途径控制细胞的增殖和分化。 MAPK是一组广泛分布于细胞浆具有丝氨酸(Ser)和苏氨酸(Thr)双重磷酸化能力的蛋白激酶。是与细胞增殖、分化和凋亡调控密切相关的细胞内信号传导酶类。MAPK信号传导通路是真核细胞介导细胞外信号到细胞内反应的重要信号传导系统，调节机体细胞的生长、分化、分裂、死亡以及细胞间的功能同步化等多种过程。迄今在哺乳动物中已鉴定出至少三种MAPK成员：(1)细胞外信号调节蛋白激酶(extracellularsignal-regulatedproteinkinase，ERK)；(2)c-Jun氨基末端激酶(c-Jun-N-terminalkinase，JNK)；(3)p38丝裂原活化蛋白激酶(p38mitogen-activatedproteinkinase，p38MAPK)；每个MAPK级联中含有至少三种被系列激活的酶：即MAPK激酶的激酶(MAPKKK)，MAPK激酶(MAPKK)以及MAPK。各种不同的细胞外刺激信号经过MAPK途径传递、放大和整合，引发涉及细胞增殖、分化、发育、炎症反应和凋亡等一系列相应的生理反应。其中ERK信号通路主要调控细胞生长和分化，而JNK/SAPK和p38信号通路主要在炎症和凋亡等应激反应中起作用。细胞周期(G1)是细胞是否继续增殖、减少分裂和开始分化的决定因素。而ERK1/2在细胞周期G0到G1的过渡期被活化，其活性一直维持到S相开始。提示细胞周期G1进程受ERK信号通路的调控。有研究证实，JNK/SAPK和p38MAPK信号通路的激活极可能与缺血再灌注导致的凋亡相关。心肌缺血再灌注可导致p38MAPK的明显活化，随后其心肌细胞凋亡增加，用p38MAPK特异性的抑制剂来抑制p38MAPK活性，可以减少心肌细胞凋亡。有实验表明p38MAPK在Cdc42导致的细胞周期在G1/S停留中是必需的。这种抑制细胞有丝分裂停止的作用可能是通过抑制cyclinD1的表达来介导的。活化的p38MAPK可使细胞有丝分裂停止。 我们推测，FGF对肠道缺血再灌注损伤保护作用可能与MAPK信号通路的激活紧密相关。 因此，在本研究中，我们采用夹闭大鼠肠系膜上动脉完全阻断血流45分钟，随后松夹恢复肠道血流作为肠道缺血再灌注模型，研究静脉内注射外源性aFGF对肠道缺血-再灌注损伤的保护作用和对ERK和p38MAPK信号通路活性变化的影响，以及MARK信号通路与肠道缺血再灌注损伤后肠粘膜屏障主动修复之间的关系。 第一部分aFGF对肠道缺血再灌注损伤的保护作用 目的：观察酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)对大鼠肠道缺血再灌注损伤的保护作用。 方法：采用肠系膜上动脉(SMA)夹闭45min后松夹造成肠道缺血再灌注(I/R)损伤动物模型。84只Wistar大鼠随机分为4组，即假手术组(C)、肠缺血组(Ⅰ)、肠缺血再灌注组(R)和aFGF治疗组(T)。根据再灌注后时间长短，R组和T组又各分为0.5h，1h，2h，6h，12h，24h组。C组分离SMA但不夹闭，45min后活杀动物取全血和小肠组织标本，Ⅰ组于SMA夹闭45min后处死动物取全血和小肠组织标本。R组和T组分别于再灌注后0.5h，1h，2h，6h，12h，24h活杀动物取血和组织标本。另取60只大鼠专用于观察R组和T组肠缺血-再灌注后2h、6h、12h、24h，48h的存活率。检测血浆D-乳酸浓度和血浆ALT、BUN、Cr、AST和CK-MB水平，光学显微镜下观察小肠组织的病理学变化。 结果：结果表明，T组大鼠存活率高于R组(p＜0.05)。I、R、T组血浆D-乳酸浓度和血浆ALT、AST、BUN、Cr和CK-MB水平在缺血和/或缺血-再灌注后升高。T组血浆D-乳酸浓度和血浆ALT、AST、BUN、Cr和CK-MB水平显著低于R组(p＜0.05)。T组小肠组织病理学损害明显较R组减轻。 结论：提示aFGF对肠道缺血再灌注损伤具有保护作用，其保护作用可能通过aFGF促分裂效应(组织发生、血管生发以及创伤修复等)与非促分裂激素样活性(低血压效应与激素分泌等)双重生理作用，促进受损伤内脏组织的主动修复。第二部分aFGF对肠道缺血-再灌注损伤保护作用的分子生物学机制研究目的：第一部分研究显示，aFGF可减轻肠道缺血再灌注损伤后小肠粘膜的形态结构损伤并改善肠屏障生理功能。然而，aFGF的保护作用机理尚未完全阐明。本研究目的在于观察肠道缺血-再灌注损伤后aFGF对大鼠肠上皮细胞MAPK活性的影响，并探讨肠道缺血-再灌注损伤时aFGF与MAPK信号通路之间的关系。 方法：采用肠系膜上动脉(SMA)夹闭45min后松夹复制成肠道缺血再灌注损伤动物模型。132只Wister大鼠随机分为假手术组(C)、肠缺血再灌注组(R)、aFGF治疗组(T)、PD98059(ERK1/2特异性的抑制剂)处理组(P)、SB203580(p38MAPK特异性的抑制剂)处理组(S)。根据再灌注后时间长短，R、T、P、S组又各分为0.25h，0.5h，1h，2h，6h，12h，24h共7个亚组。C组仅分离SMA但不夹闭，45min后活杀动物取小肠组织标本。R、T、P、S组分别于再灌注后0.5h，1h，2h，6h，12h，24h活杀动物取小肠组织标本。用免疫沉淀-激酶活性检测方法测定小肠组织中ERK1/2和p38MAPK活性水平。用逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)测定小肠组织中c-fosmRNA和c-junmRNA的表达。用免疫组织化学染色法和末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的dUTP-生物素缺刻末端标记(TUNEL)技术来评估缺血再灌注后小肠组织的细胞增殖和凋亡情况。 结果：肠道缺血再灌注可激活ERK1/2和p38MAPK信号通路。肠道缺血再灌注后，(1)R组ERK1/2活性，c-fosmRNA表达水平及PCNA阳性细胞百分率均要高于假手术组。T组比R组ERK1/2活性，c-fosmRNA表达量和PCNA阳性细胞百分率升高程度更为显著(p＜0.05)。然而，用PD98059处理能降低ERK1/2活性和c-fosmRNA表达，PCNA阳性细胞百分率减少。(2)R组p38MAPK活性和c-junmRNA表达量和TUNEL阳性细胞百分率均高于假手术组。T组p38MAPK活性和c-junmRNA表达量和TUNEL阳性细胞百分率增高幅度比R组低(p＜0.05)。SB203580处理能抑制p38MAPK活性和c-junmRNA表达，减少TUNEL阳性细胞百分率。 结论：结果表明，肠道缺血再灌注损伤可激活MAPK信号传导通路。aFGF处理可进一步增加肠道缺血再灌注后ERK1/2活性及c-fosmRNA表达，促进小肠上皮细胞增殖，同时抑制p38MAPK的活性和c-junmRNA的表达，减少肠上皮细胞凋亡和坏死，有利于小肠粘膜上皮细胞的修复及肠道屏障功能的恢复。aFGF通过MAPK信号传导通路介导对肠缺血再灌注损伤的保护作用。