本研究为了阐明米尔贝霉素A3和A4转化为C5-O-甲基米尔贝霉素A3和A4的生物催化途径，通过对冰城链霉菌C5-O-甲基转移酶基因（binD）全长序列的扩增、原核表达及体外功能分析，证明了米尔贝霉素A3和A4转化为C5-O-甲基米尔贝霉素A3和A4是由C5-O-甲基转移酶（BinD）催化完成。主要研究结果如下：　　 （1）冰城链霉菌C5-O-甲基转移酶基因（binD）全长序列的扩增。根据已报道的Streptomyces griseochromogenes，Streptomyces avermitilis，Streptomyces cyaneogriseus三种链霉菌的C5-O-甲基转移酶氨基酸序列进行比对，设计部分序列的上下游引物，扩增得到部分序列（795 bp），运用Blast程序比对，结果表明部分序列与Streptomyces griseochromogenes的C5-O-甲基转移酶基因（milD）一致性高达91％。根据milD序列设计全长序列的上下游引物，扩增得到846 bp的全长序列（GenBank登陆号：FJ531497.2），蛋白序列比对结果表明，与Streptomyces griseochromogenes C5-O-甲基转移酶（MilD）一致性为87％；与Streptomyces cyaneogriseus C5-O-甲基转移酶（NemD）和Streptomyces avermitilis C5-O-甲基转移酶（AveD）一致性分别为56％和53％。　　 （2）冰城链霉菌C5-O-甲基转移酶基因（binD）的原核表达。设计带有BamHI和HindⅢ的酶切位点引物，将全长片段克隆，并插入到表达载体pET-30a（+）中构建重组质粒pET-30a-binD，随后将其转化到E.coli BL21（DE3）中，诱导表达后，经SDS-PAGE分析表明，在31 KDa附近获得了预期条带，且表达产物在大肠杆菌中以包涵体形式存在。　　 （3）大肠杆菌生物转化米尔贝霉素A3和A4。分别以milbemycin A3和A4为底物，用含有重组质粒的E.coli BL21（DE3）于28℃进行生物转化，细胞浸提液处理后进行LC-MS检测，结果初步表明：含有重组质粒的E.coli BL21（DE3）可以将milbemycinA3和A4生物转化成C5-O-甲基milbemycinA3（r.t.8.95 min；[M+H]+m/z=543）和C5-O-甲基milbemycinA4（r.t.10.24 min；[M+H]+m/z=557）。　　 （4）冰城链霉菌C5-O-甲基转移酶（BinD）体外功能分析。利用纯化复性后的BinD蛋白来分别催化底物milbemycinA3和A4，HPLC检测到产物C5-O-甲基milbemycinA3（r.t.8.95 min）和C5-O-甲基milbemycinA4（r.t.10.24 min）的存在。这与生物转化的结果一致，从而证明在冰城链霉菌中，milbemycinA3和A4转化为C5-O-甲基milbemycinA3和A4的生物途径由BinD催化完成。　　 （5）本实验还探究了pH、温度对酶活的影响，结果表明BinD催化的最适pH为7.4，温度为28℃。　　 综上，本研究为进一步探究冰城链霉菌米尔贝霉素生物合成基因簇及基因中断奠定了重要基础。