目的:　　环状RNA(circular RNA，circRNAs)是一类不同于线性RNA分子的内源性非编码RNA，没有5末端帽结构和3末端poly(A)尾，是以共价键形成的闭合环状结构，其广泛存在于真核细胞中。研究表明大部分circRNAs分子在不同物种间是保守的，同时由于其具有组织及时空表达特异性、不易受RNA酶降解以及在疾病发生分子机理和疾病诊断中的重要潜在价值越来越受到大家的重视，近年来已成为继微小RNA(microRNA，miRNA)和长链非编码RNA(Long non-coding RNA，LncRNA)之后，RNA研究领域的又一全新热点。　　原发性肝癌(Primary Liver Cancer，PLC)是世界第五大常见恶性肿瘤、第三大肿瘤常见死因。根据组织学类型，可将其分为肝细胞肝癌(Hepatocellular Carcinoma，HCC)、胆管细胞癌(cholangiocarcinoma，ICC)和混合型肝癌。其中，HCC是原发性肝癌的主要组织学类型。中国是肝癌大国，其每年诊断率、新发病例数以及相关致死率都居高不下。肝癌发病隐匿，大部分患者出现临床症状时已处于晚期。肝癌的发生发展以及复发转移是涉及许多调控因素的复杂过程。近年来，非编码RNA(miRNA及LncRNA)在肝癌生物学功能调控以及肝癌诊断中的潜在应用受到了越来越多的关注。而circRNAs在肝癌中的相关研究甚少，其与肿瘤干性之间的相关研究更是空白，仍需对此进行深入研究。　　课题组前期与中科院计算生物所杨力教授实验室合作完成了10例肝癌配对样本mRNA和环状RNA的二代测序分析，构建了肝细胞癌差异表达circRNAs谱，结合临床样本及聚类基因分析筛选鉴定肝癌干性相关差异circRNAs。而这些circRNAs在在肿瘤干性中的具体作用及分子机制如何，并不清楚。因此，本课题希望依托团队前期已建立的肝癌环状RNA数据，以肝癌干性相关差异circRNAs为切入点，构建环状RNA-靶基因-信号通路-细胞表型的分子调控网络，阐明肝癌干性关键环状RNA及分子机理，以期寻找肝癌的最新预警分子和干预靶点。　　方法:　　1、构建肝癌组织circRNAs和mRNA表达谱:运用高通量测序技术(High-throughput sequencing)、Poly-A序列提取及接头序列分析等技术，检测circRNAs在临床肝癌样本中的表达情况，建立肝癌差异表达circRNAs谱，确定肝组织特征circRNAs;　　2、肝癌干性相关差异circRNAs鉴定:结合临床样本及聚类分析(Cluster Analysis)干性标志物，筛选出肝癌差异表达circRNAs谱中与肝癌干性相关的circRNAs;　　3、研究目标circRNA的生物学特性:应用RNA核浆分离、RnaseR处理、荧光原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridization，FISH)实验研究目标circRNA的基本生物学特性;　　4、研究目标circRNA调控肝癌细胞干性过程中的生物学功能:应用慢病毒系统分别构建目标circRNA的肝癌干扰细胞系、过表达细胞系及其相应的对照细胞系;运用CCK8增殖及克隆形成实验研究目标circRNA对肝癌细胞增殖的影响;应用体外细胞成球实验、有限稀释、体内小鼠皮下荷瘤实验研究目标circRNA对肝癌细胞成瘤能力的影响;　　5、机制探索:应用荧光定量PCR实验、流式细胞术、免疫组织化学染色方法（Immunohistochemistry，IHC）、免疫磁珠细胞分选(MACS MicroBeads)、原代肝癌细胞分选等实验研究目标circRNA对肝癌细胞干性标志物表达的影响;应用RNA结合蛋白免疫共沉淀(RNA-Binding Protein Immunoprecipitation，RIP)实验研究目标circRNA与RNA结合蛋白(RNA binding protein，RBP)之间的RNA-蛋白质相互作用;　　6、临床印证:应用一系列的免疫组化实验以及原位杂交(In situ hybridization，ISH)实验，检测本研究中相关干性基因在临床样本以及小鼠皮下荷瘤样本中的表达情况，结合临床随访数据进行生存分析，研究目标circRNA对肝细胞癌患者预后判断的价值。　　结果:　　1、高通量测序技术发现circRNAs在肝癌和癌旁存在表达差异，通过构建肝癌干性相关circRNAs表达谱，并挑选其中circZKSCAN1进行研究;　　2、circZKSCAN1通过使用其上下游的Alu重复序列来实现自身环化，表达稳定不易被RNA酶降解，且主要定位于细胞浆中;　　3、体内外实验证实circZKSCAN1能够抑制肝癌细胞干性及恶性生物学表型;　　4、circZKSCAN1可以抑制EpCAM等肝癌细胞干性基因的表达;　　5、circZKSCAN1通过竞争性结合RNA结合蛋白FMRP，阻断其与其他RNA结合，抑制靶基因表达，从而抑制肝癌细胞干性表型。　　6、circZKSCAN1表达水平与EpCAM水平在临床肝细胞癌样本中呈现负相关，可以有效地预测HCC患者的预后情况。　　结论:　　本研究首次运用高通量测序技术构建了肝癌组织circRNAs和mRNA表达谱，明确了circRNAs的表达特征，结合临床样本及聚类基因分析筛选鉴定出肝癌干性相关差异circRNAs，并从中挑选出了circRNA-ZKSCAN1进行研究。circZKSCAN1通过使用其上下游的Alu重复序列来实现自身环化，表达稳定不易被RNA酶降解，且主要定位于细胞浆中。进一步，在细胞和动物水平证实:circZKSCAN1通过竞争性结合RNA结合蛋白FMRP，阻断其与其他RNA结合，抑制靶基因表达;并抑制EpCAM等多种肝癌细胞干性基因的表达，从而抑制肝癌细胞干性及恶性生物学表型。临床肝细胞癌样本中，circZKSCAN1表达水平与EpCAM水平呈现负相关，可以有效地预测HCC患者的预后情况。本研究首次整合mRNA表达数据、系统性鉴定肝癌干性差异circRNAs，同时以RNA结合蛋白为新的切入点研究circRNAs-靶基因-生物学表型调控网络，相关结果对于深入了解circRNAs的多样化调控机制将具有非常重要的意义。