新型鹅星状病毒ZM株的分离鉴定及荧光定量PCR方法的建立

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新型鹅星状病毒(Novel goose astrovirus,GAst V)是一种单股正链RNA病毒,雏鹅感染后导致以关节、内脏出现尿酸盐沉积为特征的痛风病,甚至引起雏鹅死亡。本论文对分离到的鹅星状病毒ZM株进行动物回归试验、全基因组序列分析,并建立了GAst V的荧光定量PCR检测方法,为鹅星状病毒病流行病学调查和免疫防控提供了重要的参考依据。2021年安徽省某养鹅场发生疑似由星状病毒引起的雏鹅痛风,首先经RT-PCR检测和鹅胚传代培养,分离到一株鹅星状病毒,命名为ZM株。随后,对鹅星状病毒ZM株进行全基因组测序分析。结果显示,ZM株基因组全长7175 nt,有3个开放阅读框(ORF1a、ORF1b和ORF2)。经比对分析,ZM株ORF2基因核苷酸和氨基酸序列与Gen Bank中2014~2020年间分离毒株的同源性分别为96.7%~98.9%和96.9%~99.0%,与2016年以来在我国流行的新型鹅星状病毒处于同一进化分支。将鹅星状病毒ZM株接种LMH细胞进行培养,连续传代至第五代。结果表明,ZM株在LMH细胞中增殖良好,且不引起细胞病变。动物回归试验结果表明,ZM株经颈部皮下感染2日龄健康雏鹅,可引起体重下降、精神沉郁,并伴有腹泻和神经症状。攻毒后7天致死率达10%(2/20),攻毒鹅心脏、肝脏、胆囊、肾脏及输尿管等尿酸盐沉积明显。组织病理学观察可见肾小管上皮细胞塌陷、变性坏死及炎性细胞浸润。表明新型鹅星状病毒ZM株对雏鹅有一定的致病力。此外,建立鹅星状病毒的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法。根据GAst V的ORF1b基因序列,设计两对引物,分别用于检测与构建重组质粒,通过优化反应条件,建立标准曲线。优化后,标准曲线的线性关系R~2大于0.99;GAst V扩增曲线及熔解曲线单一;组间变异系数小;敏感性可达到100 copies/μL。应用该方法对上述ZM株攻毒雏鹅肾脏、肝脏、脾脏等组织的病毒载量进行检测,结果显示,建立的荧光定量PCR检测方法检测鹅星状病毒具有良好的特异性、灵敏度和重复性。综上,本研究分离鉴定的鹅星状病毒ZM株,基因组序列与近几年GAst V流行毒株同源性较高,攻毒雏鹅能引起肾、肝等组织发生明显的痛风病变,为新型鹅星状病毒的流行病学调查与防控提供技术支持。
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