蛋白质是生命体构成和各种生物功能得以实现的基础，几乎所有蛋白质的自然折叠构象和生物功能都是在水环境中实现的，而这些过程的实现都是水环境下的动态行为，这种动态行为的一种具体体现就是水分子在蛋白质-水分子体系中表现为一种重要的活性分子，通过溶剂化作用参与到蛋白质动态的折叠、底物识别、生物反应催化等过程中。因此深入探讨蛋白质的溶剂化动力学性质，对于揭示蛋白质折叠、稳定性以及活性的机制是至关重要的。蛋白质的溶剂化动力学主要表现为表面水合层的溶剂化动力学过程和内腔或内凹腔的水合水分子的溶剂化动力学过程。目前超快光谱技术结合核磁共振和分子动力学模拟等技术手段，已经描绘出了比较清晰的蛋白质表面溶剂化动力学特性。但是，有关蛋白质内部的溶剂化动力学研究仍比较有限，尤其是缺乏亚皮秒到皮秒时间分辨的直接动力学观测。由于蛋白质内部和内凹腔中的水合水分子在维持蛋白质结构稳定性和催化活性中扮演了重要的角色，所以有必要深入了解该区域水分子的动力学特性。因此，本论文利用皮秒分辨荧光发射谱技术和定点突变技术重点研究了葡萄球菌核酸酶(Staphylococcal nuclease，SNase)内部区域的溶剂化动力学性质。本论文的研究工作主要包括三方面内容，分别在下面几章作以详细介绍。第四章:色氨酸定点突变对SNase结构和催化性能的影响;第五章:利用外来荧光探针ANS和皮秒分辨荧光光谱技术对葡萄球菌核酸酶及其色氨酸突变体构象状态的研究;第六章:基于皮秒分辨色氨酸荧光发射谱的葡萄球菌核酸酶内部溶剂化动力学研究。同时在第一章、第二章和第三章分别对当前蛋白质溶剂化动力学研究的背景和进展、超快时间分辨光谱技术和样品的制备方法做了详尽的介绍。　　首先，我们仔细筛选出了葡萄球菌核酸酶的25个内部位点进行色氨酸替代（每个突变体中只包含一个色氨酸探针），并利用本组的生物样品制备实验室制备了大量的样品蛋白。在实施溶剂化动力学光谱实验之前，为了了解突变体的构象状态，以确保后期溶剂化动力学光谱实验数据与晶体结构能够可靠对应，我们利用多种研究手段对突变体的构象状态进行了研究。这些研究结果不仅让我们了解了突变体的基本构象状态，而且揭示了葡萄球菌核酸酶局部子结构稳定性对其整体稳定性的显著影响，并且在利用色氨酸作为蛋白质内部探针的研究中，应谨慎选取突变位点和突变模板，以尽可能获得近似自然折叠构象的突变体。比如对其疏水核心(β-barrel)结构中的位点进行色氨酸替代将影响葡萄球菌核酸酶的结构完整性和催化活性。这种结构的变化程度是相对有限的，突变体仍具有大量的二级结构，显著的三级结构，以及相对完整的活性区域，并没有出现显著的结构失序状态。葡萄球菌核酸酶内部某些重要位点对其催化活性或者底物键合作用是至关重要的。发现底物键合作用将显著优化突变体的结构完整性。这些研究成果构成了本论文的第四章内容。　　在第四章的研究中，我们通过文献调研和大量实验，发现尽管外来荧光探针ANS的稳态荧光发射谱适合用于探测蛋白质的构象状态变化，但是由于稳态发射谱是时间分辨发射的平均值，包含了许多能够反映蛋白质键合区域状态特征的独立荧光发射成分，仅仅测量稳态发射谱将会把这些独立成分的光谱信息，尤其是动力学信息掩盖掉，所以在分析蛋白质构象变化时有必要获取荧光探针的时间分辨发射谱数据。于是我们挑选了葡萄球菌核酸酶的自然折叠态样品(wild type，WT)和双点突变体中构象状态变化相对较大的两个样品(F34W/W140H和L36W/W140H)，以及它们的底物复合物作为研究对象，利用皮秒分辨ANS发射谱研究了蛋白质不同构象状态与瞬态ANS发射谱之间的关系。研究发现，葡萄球菌核酸酶的ANS时间分辨发射谱是三指数过程（ANS在低浓度时，τ1～0.25ns,τ2～3 ns，τ3＞7 ns），三个指数的荧光发射成分分别对应了溶液中自由状态的ANS分子、与蛋白表面键合的ANS分子和内部键合的ANS分子。不同构象状态（比如自然折叠态和熔融球态）的SNase具有非常不同的瞬态光谱，这些瞬态光谱参数（包括不同荧光发射成分对应的寿命、发射峰等）与蛋白质的构象状态之间具有清晰的对应关系，比如可以利用τ2和τ3以及它们对应的荧光发射峰来判断突变体相对于原生形态的构象状态变化，以及该状态下局域结构的疏水暴露程度和整体构象变化程度等等。这些研究内容构成了本论文的第五章。　　最后部分就是我们的研究核心，构成了本论文的第六章:利用色氨酸皮秒时间分辨发射谱研究蛋白质的内部溶剂化动力学性质。我们从25个双点突变体中挑选出12个突变体，重点研究了葡萄球菌核酸酶的内部溶剂化动力学性质。这些突变体的突变位点位于或接近于葡萄球菌核酸酶的一些特征区域，比如核苷酸键合腔底部、钙离子键合腔底部和疏水核心等等。研究发现，上述三个区域的溶剂化动力学性质存在显著的差别。几乎完全疏水的疏水核具有更快的溶剂化动力学时间常数（τ1～5 ps，τ2＜80 ps），而带电残基和极性残基密布的钙离子键合腔却具有最慢的时间常数(τ1＞9ps、τ2＞100 ps)，极性分布适中的核苷酸键合腔的溶剂化动力学时间常数则介于两者之间。另外，逐步增大的溶剂化能量弛豫也反映了从疏水区域到较强极性分布区域显著增强的水合化程度。这些内部区域在溶剂化动力学方面的显著差别恰恰反映了葡萄球菌核酸酶在结构完整性和催化活性方面对局域结构动力学性质的要求，比如极性分布相对适中且比较动态的核苷酸键合腔有利于蛋白质对底物的识别和绑定，而更紧束缚的钙离子键合腔则有利于局域蛋白质-水网络对底物特定位置进行的准确而高效的亲核攻击。　　除了上面的内容，论文中也详细介绍了本研究方向的基础背景，生物样品的制备流程、超快光学探测技术、时间分辨发射光谱的分析方法和溶剂化动力学关联函数的构建方法等内容。