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目的:观察动脉平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMC)大电导钙激活钾通道(large conductance Ca2+-activeted K+ channels, BKCa)的活性改变对平滑肌细胞衰老和衰老相关基因p16、p21表达的影响,以探讨BKCa活性改变在动脉血管老化发病学中的意义,并进一步阐述动脉老化发生的分子机制。方法:(1)二级清洁雄性SD大鼠,青年组和老年组各12只,采用酶消化法对动脉平滑肌进行细胞培养,免疫细胞化学鉴定平滑肌细胞α-action。选取第2代平滑肌细胞进行实验,每只大鼠均设立BKCa激活剂(NS1619)组、BKCa阻断剂(Iberiotoxin,IBTX)组和对照组(未被干扰组)。(2)用β-半乳糖苷酶染色法对上述VSMC进行衰老细胞染色,初步观察不同年龄组BKCa的活性改变对血管平滑肌细胞衰老的影响。(3)用RT-PCR方法对上述VSMC的p16和p21基因表达水平进行半定量分析,观察不同年龄动脉平滑肌细胞BKCa活性改变与衰老相关基因p16、p21关系。结果:(1)倒置显微镜下,培养的平滑肌细胞形态为长梭形,呈现平滑肌细胞典型的“峰”、“谷”样生长。免疫细胞化学鉴定细胞纯度为98%。(2)β半乳糖苷酶染色倒置相差显微镜下观察,不论青年组或是老年组,加入BKCa激活剂后衰老的平滑肌细胞数量较对照组显著减少,加入BKCa阻断剂后衰老细胞数量较对照组显著增加,差异有统计学意义(P<0.01);BKCa激活剂组、对照组和BKCa阻断剂组衰老平滑肌细胞数量在老年组均较青年组多,衰老细胞染色阳性率在青年组和老年组之间差异具有显著统计学意义(P<0.01);年龄和BKCa活性的改变对细胞衰老的影响存在着交互作用(P<0.01),BKCa的活性改变对老年组的影响更加明显。(3)PCR结果显示,无论是青年大鼠还是老年大鼠的动脉平滑肌细胞,在加入BKCa激活剂后p16表达水平较对照组明显减少,加入BKCa阻断剂后p16表达水平较对照组明显增加,差异具有统计学意义(P<0.05);BKCa激活剂组、BKCa阻断剂组和对照组培养的VSMC细胞在青年组和老年组均可检测到p21的表达,且老年组平滑肌细胞p21表达水平明显高于青年组(P<0.05),而BKCa活性改变对p21表达无影响,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:(1)NS1619可以抑制平滑肌细胞衰老,IBTX则促进平滑肌细胞衰老,这说明随着血管的老化,BKCa的基因表达减少,活性降低,这反过来又引起平滑肌细胞衰老程度的增加。(2)NS1619可以显著抑制大鼠动脉VSMC p16基因的表达,IBTX则显著增加VSMC p16基因的表达,而BKCa的活性改变对VSMC p21表达无影响,这种BKCa的活性改变对VSMC p16基因表达的影响可能是血管老化的分子机制之一。BKCa可能是通过p16INK4a/Rb/MAPK信号转导途径影响着血管的老化。(3)无论BKCa活性改变与否,老年组衰老细胞染色阳性率大于青年组,其p16和p21基因表达也较青年组明显,提示增龄本身就是细胞衰老和血管老化的独立危险因素,并且年龄和BKCa活性两个因素对平滑肌细胞衰老影响不只是简单的相加,而是有交互作用,这种交互作用使得BKCa改变对老年血管作用更明显,这可能与老年组细胞提供衰老趋势的生化改变有关,使衰老效应倍加。这提示增龄时BKCa减少,极可能是细胞衰老的一个重要机制。