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沙棘是我国药用植物宝库中一种珍贵的植物,自古以来就被蒙医、藏医广为采用.在现代,因其含有丰富的营养物质和生物活性成分,在增强免疫力、改善血液循环系统、保护心血管、抗过敏、抗氧化、抑菌防癌等方面均有显著的药理效果,但国内外研究的重点集中在沙棘黄酮、沙棘多酚等活性成分,对沙棘多糖的研究鲜有报道,尤其是其胃肠道内的消化和功能方面.本实验以沙棘果为实验材料,对沙棘多糖的提取、分离纯化、结构鉴定和体外肠道消化方面进行了探究,具体工作如下:
1.利用超声波辅助提取法对沙棘果多糖进行提取,对超声时间、超声温度、超声功率和料液比四个影响因素进行了优化,并通过正交实验确定了沙棘多糖的最佳提取工艺:超声时间为60min,超声温度为60℃,超声功率为500W,料液比为1∶35,经反复验证在此条件下多糖的提取率为7.35%.
2.通过木瓜蛋白酶和5次Sevag法脱蛋白,30%的过氧化氢脱色,8000~15000Da的透析袋法脱小分子对所提取的粗多糖进行分离纯化,蛋白质脱除率高达85.3%,多糖损失率为25.6%;然后依次以50%、70%和90%(v/v)乙醇溶液分级沉淀,得多糖组份S1、S2和S3,其中组份S1占比最高,为54.6%;再以Sephadex G-150和Sephadex G-100葡聚糖凝胶柱层析进一步分级,得到多糖组份P-S1和HP-S1,多糖回收率分别为84.5%和81.3%;通过HPLC和UV对其纯度进行验证,得到不含核酸和蛋白质的沙棘纯多糖HP-S1.
3.利用HPGPC、GC、FT-IR、NMR、SEM等仪器分析手段,对HP-S1的分子量、单糖组成、分子结构和微观形态进行了鉴定,得到HP-S1的分子量约为51645Da,表面较粗糙且有较多褶皱,是一种仅由葡萄糖构成,以α型糖苷键为主,β型糖苷键少量存在的酸性多糖.
4.以添加葡萄糖的基础培养基为阳性对照组,无碳源的基础培养基为阴性对照组,添加HP-S1的基础培养基为实验组,通过接种健康志愿者粪便在Gut Models体外消化系统中进行体外发酵实验.研究发现:
(1)HP-S1可以促进肠道菌群产生多种有机酸,尤其是丙酸、异丁酸、丁酸、戊酸、己酸,发酵到48h时含量分别为19.4、0.94、11、1.64、0.22μmol/mL;对琥珀酸、硬脂酸的产生无影响;对异戊酸的产生具有不显著的抑制作用,发酵到48h时含量仅为0.39μmol/mL,低于阴性对照组的0.54μmol/mL.HP-S1与葡萄糖具有相似的产酸能力,发酵到48h时,有机酸总量分别为70.88μmol/mL和84.92μmol/mL,而无糖阴性对照组中的有机酸总量仅为22.39μmol/mL.
(2)荧光定量PCR分析发现HP-S1对人类肠道菌群中Lactobacillus spp.和Bacteroides-Prevotella-Porphyromonas group具有促生长作用,最大增殖量分别为0h的7.1倍和4倍;对Escherichia coli有显著的抑制作用,发酵到48h时其数量仅为0h的0.5倍,而葡萄糖阳性对照组和无糖阴性对照组中分别为45.89倍和187.4倍;与葡萄糖相比,HP-S1对Bifidobacterium spp.的增殖无影响,最大增殖量出现在8h,约为0h的2.1倍.
(3)经过48h的发酵,沙棘多糖HP-S1的利用率高达92.4%,葡萄糖的利用率为95.3%.此外在发酵开始的0~8h内,HP-S1实验组中的还原糖含量从2.1mg/mL上升到3.9mg/mL,表明在HP-S1在发酵过程中被降解产生了还原糖.
(4)16S rDNA肠道基因组测序结果与RT-PCR基本一致,但未能观察到Lactobacillus的存在.测序结果分析显示HP-S1可以在维持肠道菌群组成稳定的基础上,有针对性地影响某些菌群的生长和代谢,可以有效促进Bacteroides、Prevotella_9、Megamonas和Erysipelotrichaceae_UCG-003的增殖,发酵到24h所占比例分别为20.1%、22.7%、5.3%和20%,葡萄糖阳性对照组中分别为5.6%、4.7%、1.8%和1.3%,无糖阴性对照组中分别为8.4%、0.2%、0.4%和0%.此外对Escherchia-Shigella有显著的抑制作用,发酵到24h时所占比例仅为1%,低于葡萄糖阳性对照组和无糖阴性对照组的55.9%和39.3%,而且可以显著提高肠道菌群中Bacteroidetes和Firmicutes的比例,国内外的研究表明该比例与人体的肥胖程度有关.
目前国内外有关沙棘多糖的研究表明沙棘多糖一般是由多种单糖构成的杂多糖.本研究首次从沙棘果中分离出一种仅有葡萄糖组成的均多糖.此外,通过体外肠道消化研究发现,HP-S1具有潜在的肠道益生功能,不仅可以被肠道菌群代谢产生多种有机酸,抑制有害菌的生长,而且可以促进某些特定菌群的生长,是一种极具开发价值的多糖.
1.利用超声波辅助提取法对沙棘果多糖进行提取,对超声时间、超声温度、超声功率和料液比四个影响因素进行了优化,并通过正交实验确定了沙棘多糖的最佳提取工艺:超声时间为60min,超声温度为60℃,超声功率为500W,料液比为1∶35,经反复验证在此条件下多糖的提取率为7.35%.
2.通过木瓜蛋白酶和5次Sevag法脱蛋白,30%的过氧化氢脱色,8000~15000Da的透析袋法脱小分子对所提取的粗多糖进行分离纯化,蛋白质脱除率高达85.3%,多糖损失率为25.6%;然后依次以50%、70%和90%(v/v)乙醇溶液分级沉淀,得多糖组份S1、S2和S3,其中组份S1占比最高,为54.6%;再以Sephadex G-150和Sephadex G-100葡聚糖凝胶柱层析进一步分级,得到多糖组份P-S1和HP-S1,多糖回收率分别为84.5%和81.3%;通过HPLC和UV对其纯度进行验证,得到不含核酸和蛋白质的沙棘纯多糖HP-S1.
3.利用HPGPC、GC、FT-IR、NMR、SEM等仪器分析手段,对HP-S1的分子量、单糖组成、分子结构和微观形态进行了鉴定,得到HP-S1的分子量约为51645Da,表面较粗糙且有较多褶皱,是一种仅由葡萄糖构成,以α型糖苷键为主,β型糖苷键少量存在的酸性多糖.
4.以添加葡萄糖的基础培养基为阳性对照组,无碳源的基础培养基为阴性对照组,添加HP-S1的基础培养基为实验组,通过接种健康志愿者粪便在Gut Models体外消化系统中进行体外发酵实验.研究发现:
(1)HP-S1可以促进肠道菌群产生多种有机酸,尤其是丙酸、异丁酸、丁酸、戊酸、己酸,发酵到48h时含量分别为19.4、0.94、11、1.64、0.22μmol/mL;对琥珀酸、硬脂酸的产生无影响;对异戊酸的产生具有不显著的抑制作用,发酵到48h时含量仅为0.39μmol/mL,低于阴性对照组的0.54μmol/mL.HP-S1与葡萄糖具有相似的产酸能力,发酵到48h时,有机酸总量分别为70.88μmol/mL和84.92μmol/mL,而无糖阴性对照组中的有机酸总量仅为22.39μmol/mL.
(2)荧光定量PCR分析发现HP-S1对人类肠道菌群中Lactobacillus spp.和Bacteroides-Prevotella-Porphyromonas group具有促生长作用,最大增殖量分别为0h的7.1倍和4倍;对Escherichia coli有显著的抑制作用,发酵到48h时其数量仅为0h的0.5倍,而葡萄糖阳性对照组和无糖阴性对照组中分别为45.89倍和187.4倍;与葡萄糖相比,HP-S1对Bifidobacterium spp.的增殖无影响,最大增殖量出现在8h,约为0h的2.1倍.
(3)经过48h的发酵,沙棘多糖HP-S1的利用率高达92.4%,葡萄糖的利用率为95.3%.此外在发酵开始的0~8h内,HP-S1实验组中的还原糖含量从2.1mg/mL上升到3.9mg/mL,表明在HP-S1在发酵过程中被降解产生了还原糖.
(4)16S rDNA肠道基因组测序结果与RT-PCR基本一致,但未能观察到Lactobacillus的存在.测序结果分析显示HP-S1可以在维持肠道菌群组成稳定的基础上,有针对性地影响某些菌群的生长和代谢,可以有效促进Bacteroides、Prevotella_9、Megamonas和Erysipelotrichaceae_UCG-003的增殖,发酵到24h所占比例分别为20.1%、22.7%、5.3%和20%,葡萄糖阳性对照组中分别为5.6%、4.7%、1.8%和1.3%,无糖阴性对照组中分别为8.4%、0.2%、0.4%和0%.此外对Escherchia-Shigella有显著的抑制作用,发酵到24h时所占比例仅为1%,低于葡萄糖阳性对照组和无糖阴性对照组的55.9%和39.3%,而且可以显著提高肠道菌群中Bacteroidetes和Firmicutes的比例,国内外的研究表明该比例与人体的肥胖程度有关.
目前国内外有关沙棘多糖的研究表明沙棘多糖一般是由多种单糖构成的杂多糖.本研究首次从沙棘果中分离出一种仅有葡萄糖组成的均多糖.此外,通过体外肠道消化研究发现,HP-S1具有潜在的肠道益生功能,不仅可以被肠道菌群代谢产生多种有机酸,抑制有害菌的生长,而且可以促进某些特定菌群的生长,是一种极具开发价值的多糖.