朱砂叶螨Tetranychus cinnabarinus隶属于蜱螨亚纲Acari、叶螨科Tetranychidae、叶螨属Tetranychus。该螨是植食性害螨,寄主广泛,为害各种花卉、豆类、棉花、蔬菜、桑树和果树等经济作物和观赏植物,造成严重的经济损失,是一种世界性经济害螨。长期以来,杀虫剂在控制朱砂叶螨的为害中起到重要的作用,同时该螨对多种杀虫剂已经产生不同程度的抗性。本文以朱砂叶螨为研究对象,在分析苯甲酰基脲类杀虫剂除虫脲对朱砂叶螨毒性效应的基础上,进一步探讨了朱砂叶螨对除虫脲胁迫的生理生化反应;通过克隆朱砂叶螨几丁质合成酶基因全长,采用生物信息学方法对其序列进行分析,研究了几丁质合成酶基因的mRNA表达模式以及异源表达情况;综合上述研究结论,系统分析了朱砂叶螨对苯甲酰基脲类杀虫剂除虫脲的响应机制,为理解昆虫(螨)对杀虫剂的反应机制提供参考。主要研究结果如下:1、除虫脲对朱砂叶螨的毒力以及亚致死效应研究除虫脲对朱砂叶螨生长发育不同阶段(卵、幼螨、若螨和雌成螨)的半数致死浓度(LC50)分别为15.83、16.37、18.54和24.77 mg/L。说明除虫脲对朱砂叶螨生长发育的不同阶段均产生毒性,毒力大小依次为:卵>幼螨>若螨>雌成螨;除虫脲对朱砂叶螨卵的毒力最大,其毒力是雌成螨的1.57倍。使用亚致死剂量(LC10、LC20、LC30、LC40和LC50)的除虫脲分别处理卵、幼螨、若螨和雌成螨,可降低朱砂叶螨卵的孵化率,药剂浓度越大,卵的孵化率越低;而对于存活的卵所孵化出的幼螨的存活率也是随着药剂浓度的增加而降低,LC50处理组的幼螨的存活率仅为对照组的20.43%。当用除虫脲处理朱砂叶螨的幼螨和若螨后,其存活率随药剂剂量的增加而下降。除虫脲处理朱砂叶螨雌成螨后,对其寿命、产卵量及其所产卵的孵化率均有影响,低剂量(LC10、LC20和LC30)药剂对其平均每雌每日产卵量和平均总产卵量都有显著的刺激作用,在LC30处理组达到最高值;高剂量(LC40和LC50)下却呈现抑制作用;雌成螨平均寿命和产卵期随着除虫脲浓度的加大而逐渐缩短。对于雌成螨所产下的卵的孵化率,随除虫脲浓度加大,卵的孵化率逐渐降低。除虫脲对朱砂叶螨生长发育的不同阶段均产生毒性,并可对朱砂叶螨实验种群的生长发育和繁殖产生影响。2、朱砂叶螨对除虫脲胁迫的生理生化反应研究随除虫脲浓度增加,朱砂叶螨不同螨态(卵、幼螨、若螨和雌成螨)中丙二醛(MDA)含量逐渐增加,在药剂处理组LC50时MDA含量达到最高值。无论在对照组还是各个除虫脲的药剂处理组,朱砂叶螨幼螨、若螨和雌成螨中MDA含量始终高于卵中。说明除虫脲对朱砂叶螨造成了氧化胁迫,并且导致了生物膜的脂质过氧化。朱砂叶螨不同螨态中SOD、CAT和POD活性总体表现为先被诱导激活而后被抑制的变化趋势。和对照组相比,随药剂除虫脲浓度的增加(从LC10、LC20到LC30),SOD和CAT活性逐渐增加,在LC30处理组活性达到最高;但浓度从LC40增加到LC50时,SOD活性呈现下降。朱砂叶螨不同螨态中SOD活性,若螨和雌成螨均高于卵和幼螨。随除虫脲药度的增加,朱砂叶螨不同螨态POD活性逐渐增加,在LC40药剂处理组活性达到最高。在不同螨态中POD活性大小为:卵<幼螨<若螨<雌成螨。随除虫脲浓度的增加,朱砂叶螨不同螨态中谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)活性逐渐增加,在LC50药剂处理组活性达到最高值;GSTs活性在朱砂叶螨不同螨态中的变化趋势为:卵<幼螨<若螨<雌成螨。随除虫脲浓度的增加,朱砂叶螨不同螨态中机体总抗氧化活力T-AOC逐渐增加,高剂量处理组LC50的活性达到最大值。朱砂叶螨若螨和雌成螨中T-AOC始终高于卵和幼螨。除虫脲降低朱砂叶螨不同螨态的几丁质含量;朱砂叶螨不同螨态的LC50药剂处理组的几丁质含量最低。3、朱砂叶螨几丁质合成酶基因全长的克隆和序列的分析首次克隆获得朱砂叶螨几丁质合成酶基因1的全长cDNA序列,命名为TcCHS1,将此序列提交到NCBI中,获得GenBank登录号为KM242062。TcCHS1的cDNA全长为4881 bp,包括198 bp的5’非翻译区,4425 bp的开放阅读框,258 bp的3’非翻译区,开放阅读框编码1474个氨基酸,预测其蛋白质分子质量约为168.35 ku,理论等电点为6.26。TcCHS1基因编码的蛋白质的序列进行分析表明,该基因编码的氨基酸序列有17个跨膜螺旋,为典型的跨膜蛋白。推测该基因编码的蛋白质存在3个结构域:结构域A、结构域B和结构域C。结构域A在几丁质合成酶的N端区,由606个氨基酸组成,包含10个跨膜螺旋。结构域B在几丁质合成酶的中心区,由大约299个氨基酸组成,包含EDR和QRRRW这两个几丁质合成酶基因的标签序列。结构域C(包含907～1 474个氨基酸)位于C端。预测其糖基化位点为5个,分别为NRTG、NLSD、NLST、NITF和NSSG。朱砂叶螨TcCHS1氨基酸序列中不存在信号肽,说明其编码的蛋白不属于分泌蛋白。氨基酸序列同源性分析结果表明:TcCHS1与其它昆虫该基因编码蛋白的氨基酸序列相似度在50%左右,与同属于叶螨科的二斑叶螨的氨基酸相似度最高(98%),与西方盲走螨的相似度为55%。在MEGA软件中基于邻接法(NJ)构建的分子系统进化树的结果也表明TcCHS1与其它昆虫的CHS1聚为一大支,并且和同属于叶螨科的二斑叶螨具有最近的亲缘关系。4、朱砂叶螨几丁质合成酶基因的mRNA表达模式TcCHS1基因在朱砂叶螨的不同螨态(卵、幼螨、第1若螨、第2若螨、雌成螨和雄成螨)中均有表达,在卵和雌成螨中的表达量较高,在第2若螨的表达量最低。由此推测TcCHS1基因可能在朱砂叶螨生长发育过程中具有重要作用。为了探讨除虫脲对朱砂叶螨几丁质合成酶基因的影响,我们使用不同浓度的除虫脲分别处理朱砂叶螨的卵、幼螨、若螨和雌成螨后,以朱砂叶螨β-actin作为内参基因,运用荧光定量PCR手段检测了除虫脲对TcCHS1的mRNA表达量的影响,结果发现,除虫脲引起不同螨态朱砂叶螨体内TcCHS1基因的表达量上调。在分子水平上,除虫脲可能作用于朱砂叶螨的几丁质合成酶基因。5、朱砂叶螨几丁质合成酶基因的原核表达研究利用限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ的双酶切以及重组DNA技术成功构建朱砂叶螨几丁质合成酶基因基于pET-32a(+)的原核表达载体,并且采用SDS-PAGE电泳成功检测到目的蛋白的表达,这为进一步深入研究朱砂叶螨TcCHS1基因编码的蛋白质的特性和生理功能奠定了基础。