研究背景:脊髓损伤是一种常见的高致残率的神经系统疾病,在世界范围内的发病率大约是250-906/百万人,其中美国的发病率最高。在中国据不完全统计,现有截瘫患者约40万人,且每年新增约1万人。脊髓损伤主要见于年轻男性(发病高峰为30岁),常见的病因包括车祸外伤、工伤事故、运动损伤、坠落、暴力袭击和战伤等。脊髓损伤常导致持续的器官功能障碍和永久的神经功能缺损,严重影响患者生活质量,而且需要高额的治疗和护理费用,给家庭和社会带来沉重的负担。尽管每年有大量的资金和人力投入到脊髓损伤的基础和临床研究中去,但收效甚微,到目前为止临床上仍缺乏有效的治疗药物,如果能找到一种有效的治疗脊髓损伤的药物或研究方向将具有重大的意义。脊髓损伤后的病理生理过程主要包括原发性损伤和继发性损伤,其中原发性损伤主要是指不可逆的机械性损害,如出血和伤灶细胞(包含神经元、少突胶质细胞和内皮细胞等)被机械性破坏;而继发性脊髓损伤主要包括兴奋性中毒、氧化应激、缺血、炎症反应、离子平衡和凋亡等。上述这些病理生理过程最终都将引起细胞死亡,进而造成脊髓功能障碍。脊髓损伤后永久性的神经功能障碍由两者共同作用所造成的。因原发性损伤不可逆,也无法控制,所以目前对脊髓损伤的研究都集中在继发性损伤。通过对继发性损伤机制的深入了解,找到新的调控靶点进而减轻继发性损伤,从而促进脊髓功能恢复是当前研究的难点和热点。而脊髓损伤后继发性损伤的病理生理过程中最基本和核心的问题就是细胞死亡,所以对脊髓损伤后神经细胞死亡机制的研究具有重大的意义。通常我们认为细胞的死亡方式有三种类型:凋亡,自噬和坏死。凋亡是一种以细胞皱缩,染色质浓缩、核碎裂和凋亡小体形成为主要特征的细胞死亡方式;自噬是由Ashford和Porter在1962年发现细胞内有"自己吃自己"的现象后提出的,表现为自噬小体形成的一种细胞死亡方式,主要是存在于机体的自我调节,以实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新;坏死的典型特征表现为细胞体积增大,细胞器肿胀,质膜破裂。长久以来坏死都被认为是无序的、不可逆的并且无法被调控,所以脊髓损伤后细胞死亡的研究大多数是关于凋亡和自噬的。然而近十余年来越来越多的证据表明一部分坏死像凋亡一样具有可调控的机制。首先一些研究发现在使用半胱氨酸蛋白酶(caspase)抑制剂后能使肿瘤坏死因子(TNF)诱导的细胞凋亡转而发生细胞坏死;2000年Holler等发现死亡受体Fas在受体相互作用蛋白1(RIP1)激活的情况下通过Fas和死亡受体结合可以引起不依赖caspase的非凋亡性的细胞死亡。这些研究表明一部分坏死可能和凋亡一样是按照某种程序发生的,是可以调节的。2005年Degterev等合成了一种小分子物质Necrostatin-1(Nec-1),其可以特异性抑制TNF诱导的细胞坏死,并将这种不同于一般细胞坏死的模式称作"necroptosis",它一般被译为程序性坏死。自此程序性坏死被用来描述这类由受体介导、不依赖caspase蛋白酶、高度调节的并具有典型坏死性细胞死亡形态的细胞死亡过程。而Nec-1也被作为一种识别程序性坏死的工具药广泛应用于体内和体外实验中。RIPs是一类具有特异性的丝氨酸/苏氨酸激酶活性的蛋白,它们具有共同的N端结构域和不同的C端结构域,在调节细胞存活或死亡的信号通路中发挥着重要的作用。RIP1敲除的小鼠凋亡反应在淋巴和脂肪组织中过度激活,出生数天后即死亡,证实了 RIP1的促进细胞存活的作用。CD95L,TRAIL或者TNF+Z-VAD-FMK等无法诱导RIP1敲除的T细胞产生程序性坏死,同时在JurkatT细胞中RIP1过表达可诱导程序性坏死,这些研究则表明了 RIP1在促进细胞死亡中的作用。所以RIP1既能传递促存活也能传递致死信号。RIP3拥有一个N末端KD结构域,通过与RIP1的C末端RIP同源结合基序(RHIM)的结构域结合。与RIP1不同,RIP3不参与NF-kB信号通路,它被认为是肿瘤坏死因子I型受体(TNFR1)诱导程序性坏死发生中不可或缺的部分。2008年Degterev等发现Nec-1的作用靶点为RIP1。2009年三个独立的研究小组同期在cell和science发表了 3篇关于RIP3蛋白功能的研究工作,进一步揭示了 RIP激酶调控细胞坏死的分子机制。一系列的研究表明RIP1和RIP3是参与程序性坏死的关键分子蛋白,其相互作用是启动程序性坏死的关键。程序性坏死的发生消耗能量,增加代谢,导致线粒体产生大量的ROS,最终导致细胞出现坏死形态的死亡。而随着研究的深人,人们发现程序性坏死参与了诸多临床疾病,例如缺血再灌注损伤、病毒感染、创伤、肿瘤和炎症等。程序性坏死可以加速肿瘤细胞死亡,增加其对抗肿瘤药物的敏感性。一项关于儿童急性淋巴细胞性白血病的研究发现程序性坏死有助于克服急性淋巴细胞性白血病(ALL)的糖皮质激素抵抗;紫草素可以诱导恶性上皮细胞及白血病细胞发生坏死,并且这一过程不被凋亡抑制剂(Z-VAD)和自噬细胞抑制剂(3-MA)所影响,但可被Nec-1完全抑制,表明其诱导的是程序性坏死而不是凋亡。而且在过表达P糖蛋白、BCL-xl和BCL-2等抗凋亡诱导蛋白后,紫草素的抗肿瘤作用并未减弱,进一步说明其是通过程序性坏死发生作用。所有这些结果表明程序性坏死可能是肿瘤化疗特别是具有化疗抗药性的肿瘤治疗的一个新方向。敲除RIP3的细胞感染牛痘病毒后明显更耐受激活的T细胞和TNFα诱导的细胞死亡,同时TNFα可以在缺乏Z-VAD-FMK的情况下诱导牛痘病毒感染的细胞发生程序性坏死,表明程序性坏死在病毒感染的细胞死亡中起着重要的作用。RIP3敲除的小鼠较野生型小鼠更易遭受病毒感染,表明机体通过诱导程序性坏死来清除病毒感染的细胞。上述结果表明程序性坏死可能参与抗病毒的机制。RIP3敲除的小鼠更耐受结肠和小肠的上皮细胞死亡和炎症发生,表明RIP3调节的程序性坏死介导了肠炎的发生。Degterev等在小鼠大脑中动脉缺血模型中发现发现程序性坏死参与了脑缺血再灌注后的损伤,通过Nec-1抑制程序坏死可保护神经元,显著减小坏死面积,促进功能恢复;King等和SU等均分别证明通过Nec-1抑制脑出血后的程序性坏死可显著减轻脑水肿、减少出血量和促进神经功能恢复;You等在小鼠脑创伤模型中发现Nec-1抑制程序性坏死,可减轻脑组织损伤,促进神经功能恢复。程序性坏死与脊髓损伤后神经细胞死亡的关系目前仍鲜有报道,脊髓损伤作为一种急性创伤性重症疾病,早期神经细胞的死亡形式更多的表现为坏死样,所以坏死对脊髓损伤后功能恢复的影响可能较凋亡和自噬更大。如果脊髓损伤后大量的坏死细胞有一部是程序性坏死,是可调控的,将会加深我们对脊髓继发性损伤的病理生理机制的理解。而抑制程序性坏死将会成为我们药物研发的新方向,为脊髓损伤的药物治疗带来新的曙光。因此本研究拟探讨程序性坏死在小鼠脊髓继发性损伤中的作用,深入认识其发生发展的机制,为脊髓损伤治疗的药物开发提供新的靶点和思路。第一部分程序性坏死在小鼠实验性脊髓损伤后神经细胞死亡中的作用研究目的:1.验证程序性坏死参与了脊髓损伤后的继发性损伤,是小鼠脊髓继发性损伤中神经细胞死亡一种重要的方式;2.探索Nec-1抑制程序性坏死后能否减轻脊髓继发性损伤,及对下肢运动功能恢复的影响;方法:1.将健康成年雌性LCR小鼠随机分为3组:1)sham组:仅仅切除椎板,充分暴露脊髓硬膜,不钳夹脊髓;2)SCI+DMSO组:建立脊髓损伤模型后鞘内给予4μl的DMSO;3)SCI+Nec-1组:建立脊髓损伤模型后鞘内给予4μl的Nec-1(4mM);2.应用血管夹钳夹法建立小鼠脊髓损伤模型;3.通过PI活体标记法评估各组小鼠脊髓组织内24小时细胞坏死情况;4.通过HE染色评估各组小鼠脊髓损伤后24小时脊髓组织损伤程度;5.通过尼氏染色评估各组小鼠脊髓损伤后24小时脊髓组织内神经元存活情况;6.通过蛋白免疫印迹实验检测小鼠脊髓组织内24小时Caspase3的表达;7.通过TUNEL染色评估各组小鼠脊髓损伤后24小时脊髓组织内细胞凋亡情况;8.通过Basso mouse scale(BMS)评估小鼠脊髓损伤后1、3、5、7、14和28天后肢运动功能的恢复情况。结果:1.与SCI+DMSO组相比,Nec-1能显著减少小鼠脊髓损伤后24小时的PI染色阳性细胞数(PP<0.05);2.在实验性小鼠脊髓损伤后24小时,通过HE染色我们发现在损伤区域细胞大量坏死,形成典型的类似"海绵"的空洞状结构。SCI+DMSO组小鼠脊髓损伤灶面积较大(P<0.05),Nec-1能减轻小鼠脊髓损伤后的组织损伤;3.在实验性小鼠脊髓损伤后24小时,通过尼氏染色我们在SCI+Nec-1组较SCI+DMSO组小鼠脊髓组织中观察到更多存活的神经元(P<0.05),表明Nec-1能减轻小鼠脊髓损伤后神经元的死亡;4.蛋白免疫印迹实验显示脊髓损伤后24小时脊髓组织内Caspase3的表达增高,但SCI+Nec-1组和SCI+DMSO组之间无明显差异(P>0.05),即Nec-1不影响小鼠脊髓损伤后的capase-3的表达;5.TUNEL染色显示脊髓损伤后24小时脊髓组织内TUNEL染色阳性细胞数在SCI+Nec-1和SCI+DMSO组之间无明显差异(P>0.05),即Nec-1不影响小鼠脊髓损伤后的细胞凋亡;6.在SCI+Nec-1组和SCI+DMSO组伤后28天内均能观察到后肢运动功能的缓慢恢复(BMS评分升高),且从伤后第7天开始Nec-1处理组运动功能改善更明显,表明Nec-1能促进脊髓损伤后肢运动功能恢复。结论:程序性坏死是小鼠脊髓损伤后一种重要的神经细胞死亡方式,通过Nec-1特异性抑制程序性坏死可以减轻脊髓继发性损伤,并促进下肢运动功能恢复;第二部分RIP1/RIP3通路在小鼠脊髓损伤后神经细胞程序性坏死中的作用目的:1.验证RIP1/RIP3通路参与了小鼠脊髓损伤后神经细胞程序性坏死的过程;2.探索Nec-1抑制小鼠脊髓损伤后神经细胞程序性坏死的机制。方法:1.将健康成年雌性LCR小鼠随机分为4组:1)sham组:仅仅切除椎板,充分暴露脊髓硬膜,不钳夹脊髓;2)SCI组:建立脊髓损伤模型后不给予其它特殊处理;3)SCI+DMSO组:建立脊髓损伤模型后鞘内给予4μ1的DMSO;4)SCI+Nec-1组:建立脊髓损伤模型后鞘内给予4μ1的Nec-1(4mM)。2.应用血管夹钳夹法建立小鼠脊髓损伤模型;3.通过蛋白免疫印迹法评估脊髓损伤后组织内6小时、12小时、24小时和48小时RIP1和RIP3的表达4.通过蛋白免疫印迹法评估Nec-1对脊髓损伤后24小时组织内RIP1和RIP3表达的影响;5.通过免疫共沉淀评估伤后24小时不同组小鼠脊髓组织内RIP1和RIP3的相互作用;6.检测24小时脊髓组织内一氧化氮、一氧化氮合成酶含量、氧化型谷胱甘肽/谷胱甘肽水平、丙二醛含量、ATP含量和ROS水平;7.通过电镜观察小鼠脊髓损伤24小时后脊髓组织神经元线粒体损伤情况。结果:1.蛋白免疫印迹实验显示RIP1在小鼠脊髓组织内有较高的表达,实验性脊髓损伤后仍维持在较高的表达水平,各时向点无明显变化。而RIP3在正常脊髓组织内表达相对较低,脊髓损伤后RIP3的表达水平显著升高,但48小时内各时相点间无显著区别;2.在SCI+Nec-1组和SCI+DMSO组中,小鼠脊髓组织RIP1和RIP3表达无明显差异(P>0.05),即Nec-1不影响脊髓损伤后RIP1和RIP3的表达;3.免疫共沉淀技术显示脊髓损伤后24小时RIP1和RIP3的相互作用增强,而Nec-1能抑制损伤后24小时脊髓组织中RIP1和RIP3的相互作用;4.Nec-1能减少小鼠脊髓损伤后早期NO的产生、iNOS的表达;Nec-1能减轻小鼠脊髓损伤后早期谷胱甘肽的氧化水平;Nec-1能减轻小鼠脊髓损伤后早期ATP的耗竭;Nec-1能减少小鼠脊髓损伤后早期MDA和ROS的含量。5.电镜观察显示Nec-1能保护脊髓损伤后神经元线粒体的超微结构;结论:程序性坏死是小鼠脊髓损伤后一种重要的细胞死亡方式,Nec-1对脊髓损伤后RIP1和RIP3的表达无明显影响,而是通过抑制RIP1和RIP3的相互作用阻止坏死小体形成,进而抑制程序性坏死,减轻脊髓继发性损伤。Nec-1能降低ROS产物,减轻氧化应激损伤,保护线粒体功能。