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大环内酯类、林可酰胺类和链阳性菌素B(MLSB)等抗生素被广泛地应用于临床治疗革兰氏阳性菌引起的感染性疾病。这些抗生素通过靶向结合50S核糖体亚基内肽基转移酶中心抑制细菌蛋白质合成。但是,随着抗生素的应用,细菌耐药性问题也伴随而来。文献报道MLSB耐药机制主要由Erm(erythromycin ribosome methylase)甲基化酶通过甲基化修饰23S rRNA介导。但详细的Erm甲基化机制与特点鲜有研究。在解没食子酸链球菌巴氏亚种(S.gallolyticus subsp.pasteurianus)中,本实验室研究发现了erm基因介导的大环内酯耐药及ermB单核苷酸多态性引起ErmB突变。本研究致力于建立Erm甲基化体系,并探讨ErmB、ErmT及ErmB突变体的甲基化作用,为临床分离株的大环内酯耐药表型提供生化依据,并为开发大环内酯增效剂奠定基础。研究结果如下:1.ErmB、ErmT甲基化体系的建立从美国Green实验室获得少量pcI857、pLK35和pMBP-MS2等质粒,将这些质粒重新转化后提取并测序。通过定点突变和克隆等方法构建了解没食子酸链球菌23S rRNA的表达质粒pLK23SMS2。将pcI857转化至DH5α感受态细胞后,将其制备成新的感受态细胞,再利用电转化方法将质粒pK23SMS2转化至该感受态细胞中,通过温控在42℃大量养菌高表达S.gallolyticus subsp.pasteurianus 23S rRNA。利用亲和纯化的方法纯化出MBP-MS2蛋白后,亲和纯化S.gallolyticus subsp.pasteurianus 23S rRNA。再利用亲和纯化方法纯化出ErmB、ErmT蛋白。2.ErmB、ErmT的甲基化活性以3H标记的S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体,对ErmB、ErmT蛋白和底物23S rRNA进行酶促动力学试验。利用液闪仪检测转移到23S rRNA上的放射性,比较两个蛋白的甲基化活性。试验结果表明,ErmB和ErmT均可以甲基化修饰S.gallolyticus subsp.pasteurianus 23S rRNA,但ErmT甲基化活性要高于ErmB。3.ErmB、ErmT甲基化作用位点通过NCBI网站将E.coli 23S rRNA的序列与S.gallolyticus subsp.pasteurianus23S rRNA序列比对后,预测出S.gallolyticus subsp.pasteurianus 23S rRNA序列上的2057位的腺嘌呤与E.coli 23S rRNA的A2058吻合。通过定点突变将A2057突变为G后,亲和纯化出A2057G突变体的23S rRNA。通过酶促动力学方法检测突变体23S rRNA的活性。试验结果表明A2057G突变体的活性低于10%,说明ErmB、ErmT在S.gallolyticus subsp.pasteurianus 23S rRNA靶位点可能为A2057。4.ErmB突变体的甲基化活性通过定点突变的方法构建ErmB突变体I22V、D181G、V182A和V226I,进行酶促动力学试验,结果表明I22V、D181G、V182A与野生型ErmB的活性相当,但V226I活性比其他突变体的活性高。总体趋势与本实验室对这些突变体MIC值测定结果一致。5.Erm甲基化酶进化树的构建利用Mrbays3.1.2生物信息学软件构建了Erm甲基化酶的系统发育树,发现ErmT与ErmC、ErmY氨基酸序列同源性高,同源性均为77%,ErmB与ErmT的同源性为52%。结论:ErmB、ErmT均可以甲基化修饰S.gallolyticus subsp.pasteurianus 23S rRNA,且被修饰的位点可能是A2057位点。ermB单核苷酸多态性导致的ErmB突变体中,I22V、D181G、V182A突变体甲基化活性与野生型ErmB活性相当,但V226I突变体活性较其他突变体高。这些活性测试结果与本实验室MIC测定结果一致,为临床分离株大环内酯耐药表型提供了生化依据。