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随着人口老龄化和人们生活方式的改变,糖尿病患者生存期明显延长。随之而来的慢性并发症越来越多见,其中关于自主神经及周围神经病变已有很多研究,糖尿病同样也会引起中枢神经系统损伤。但因缺乏特征性的早期诊断工具,故对糖尿病脑病的研究较少。糖尿病脑病的特点是神经化学物质和脑组织结构异常从而导致脑功能改变。脑微血管病变作为糖尿病的特征性并发症,其结构的病理改变主要表现为毛细血管基底膜增厚,周细胞丢失,以及继发的血管内皮细胞(vascular endothelial cell,VEC)增生和功能紊乱,进而脑血管屏障功能破坏及进行性闭塞,组织缺氧等。糖尿病脑病中微血管损伤与认知功能障碍密切相关。这些功能改变是与脑组织细胞内慢性高糖作用下导致脑组织结构和神经化学物质的改变相伴随的。第一部分糖尿病大鼠侧脑室脉络丛及脑小血管基底膜的观察目的:本实验以链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)诱导的实验性糖尿病大鼠作为研究对象,观察不同发病时期糖尿病大鼠侧脑室脉络丛和脑小血管基底膜的变化,探讨糖尿病对脑小血管结构损伤的机制,为临床早期诊断、治疗提供实验室依据。方法:⑴实验分组采用成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠,随机分为2组:STZ诱导糖尿病组(STZ组)和对照组(CON组)。每组按照模型建立成功后的时间分为2周、6周、10周3个亚组。⑵模型制备实验组大鼠禁食12小时后按55mg/kg体重给予STZ腹腔内注射,连续3天监测非空腹血糖大于或等于16.7mmol/L视为模型制备成功。⑶取材及样品制备蜡块样品制备:各组大鼠在相应的时间点称重、测血糖后,腹腔注射10%水合氯醛麻醉,以4%多聚甲醛溶液全身灌流固定后,断头取脑,将所取脑组织固定于上述溶液,石蜡包埋,制成蜡块,分别做HE染色,三色染色等光镜观察。电镜样品制备:各亚组大鼠在相应的时间点称重、测血糖后,腹腔注射10%水合氯醛麻醉,以4%多聚甲醛和2.5%戊二醛混合液全身灌流固定后,断头取脑,取1mm2大小脑皮层组织立即放于4%戊二醛固定,之后经1%饿酸后固定,系列丙酮脱水、浸透,环氧树脂包埋,半薄切片做定位分析后,再制备超薄切片,进行醋酸铀-枸橼酸铅电子染色,JEM-1230型透射电子显微镜观察摄影。⑷糖尿病大鼠侧脑室脉络丛和脑小血管基底膜结构的观察用Masson三色染色法光镜下观察糖尿病大鼠侧脑室脉络丛和脑小血管基底膜的形态改变,用透射电镜观察糖尿病大鼠脑小血管超微结构的改变。结果:糖尿病大鼠侧脑室脉络丛和脑小血管基底膜结构的观察:光镜观察:对照组大鼠侧脑室脉络丛和脑小血管基底膜结构未见破坏。实验组大鼠:侧脑室脉络丛毛细血管外基底膜结构模糊、溶解,基底腔隙增宽。脑小血管基底膜增厚,结构模糊、溶解,断裂。电镜观察:对照组大鼠脑小血管超微结构未见破坏。实验组大鼠:脑小血管VEC和周细胞水肿,基底膜结构模糊,溶解,断裂。小结:在实验性糖尿病大鼠模型中观察到,随着病程进展,侧脑室脉络丛毛细血管外基底膜结构模糊、溶解,基底腔隙增宽。脑小血管基底膜增厚,溶解,断裂,VEC和周细胞水肿。说明糖尿病可引起血脑屏障破坏,是导致脑组织结构改变的病理基础之一。第二部分糖尿病大鼠脑小血管α-SMA及CD31表达的研究目的:本实验以链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)诱导的实验性糖尿病大鼠作为研究对象,观察不同发病时期糖尿病大鼠脑小血管α-SMA和CD31的表达变化,探讨糖尿病对脑小血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)及VEC损伤的机制,为临床早期诊断、治疗提供实验室依据。方法:⑴实验分组采用成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠,随机分为2组:STZ诱导糖尿病组(STZ组)和对照组(CON组)。每组按照模型建立成功后的时间分为2周、6周、10周3个亚组。⑵模型制备实验组大鼠禁食12小时后按55mg/kg体重给予STZ腹腔内注射,连续3天监测非空腹血糖大于或等于16.7mmol/L视为模型制备成功。⑶取材及样品制备蜡块样品制备:各组大鼠在相应的时间点称重、测血糖后,腹腔注射10%水合氯醛麻醉,以4%多聚甲醛溶液全身灌流固定后,断头取脑,将所取脑组织固定于上述溶液,石蜡包埋,制成蜡块,做免疫组织化学染色,光镜观察。⑷免疫组织化学染色:取上述蜡块,做5μm连续切片,血清封闭,分别加α-SMA及CD31一抗,经二抗,三抗孵育,DAB显色,苏木精复染,酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片,光学显微镜下观察α-SMA和CD31表达情况。⑸统计分析:实验结果以均值+标准差(x±s)表示,采用SPSS13.0统计软件进行统计学分析。组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),统计结果以P<0.05为有显著差异。结果:⑴各亚组STZ大鼠的体重较相应亚组CON大鼠的体重明显下降,存在统计学差异(P<0.05)。10周组STZ大鼠体重较2周组STZ大鼠明显下降,存在显著差异。6周组和10周组CON大鼠的体重较2周组CON大鼠的体重明显增加,存在统计学差异(P<0.05)。⑵各亚组STZ大鼠的血糖水平较相应亚组CON大鼠的血糖水平明显升高,存在统计学差异(P<0.05)。各亚组CON大鼠之间的血糖水平无显著差异。6周组和10周组STZ大鼠的血糖水平较2周组STZ大鼠的血糖水平明显升高,存在统计学差异(P<0.05)。⑶2周组中,α-SMA的表达在STZ大鼠与CON大鼠之间比较无显著差异。6周组和10周组中,α-SMA的表达在STZ大鼠较相应亚组CON大鼠明显减少,存在统计学差异(P<0.05)。6周组和10周组STZ大鼠的α-SMA的表达较2周组STZ大鼠明显减少,存在统计学差异(P<0.05)。各亚组CON大鼠之间的表达无显著差异。⑷2周组中,CD31的表达在STZ大鼠与CON大鼠之间比较无显著差异。6周组和10周组中,CD31的表达在STZ大鼠较相应亚组CON大鼠明显增多,存在统计学差异(P<0.05)。6周组和10周组STZ大鼠的CD31的表达较2周组STZ大鼠明显升高,存在统计学差异(P<0.05)。各亚组CON大鼠之间的表达无显著差异。小结:在实验性糖尿病大鼠模型中观察到:在6周组和10周组,脑小血管CD31的表达较其相应亚组CON大鼠明显增多,而α-SMA表达较其相应亚组CON大鼠明显减少。表明脑小血管VSMC表型转化可能参与了糖尿病脑血管病的发病,且在高血糖作用下,脑小血管VSMC的损伤可能与VEC的损伤相互影响。