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氟苯尼考(Florfenicol, FFC)作为一种酰胺醇类抗生素,全世界范围内使用广泛,是我国使用量最大的兽用抗生素,主要用于防治畜禽消化道和呼吸道细菌性感染疾病。随着FFC在养殖业中的广泛使用,有关FFC耐药性问题也越来越受到重视,但该药的使用是否会造成养殖场环境土壤中氟苯尼考耐药基因(Florfenicol Resistance Genes, FRGs)的污染还不得而知,尤其是可同时介导治疗人医临床多重耐药G+菌感染性疾病的利奈唑胺耐药的cfr和optrA基因。本文将针对这个问题开展研究,探寻养猪场FFC使用后对土壤环境中FRGs的污染水平的影响。首先,本研究对长期使用FFC的猪场土壤中FRGs的丰度进行研究。选取近几年一直使用FFC的6个养猪场,采集长期使用猪场排泄物灌溉的土壤,包括3个FFC年均使用量较多且使用年限较长的猪场(HN-S-1、HN-S-2和HN-S-3)及3个使用量较少的猪场(HN-S-4、HN-S-5和HN-S-6)。通过非细菌培养方法直接提取样品中细菌总DNA,利用荧光定量PCR对样品中的FRGs (fexA、 fexB、cfr、optrA、floR和lpexA)进行检测,结果发现所有猪场土壤中均呈现不同程度的FRGs污染,其中在所有猪场土壤中均检出optrA基因,cfr基因也在5个猪场土壤中发现,而空白土壤(距离猪场上游>5kmm的山坡翻新土壤)中未发现任何FRGs的存在。另外,FFC使用年限较长的3个猪场HN-S-1、HN-S-2和HN-S-3中FRGs的整体水平高于其他3个猪场,而cfr,optrA和fexA在HN-S-2和HN-S-3中的相对丰度明显高于其他样品(删.001),fexB仅在HN-S-2和HN-S-3中检出,推测FFC在猪场的使用会造成FRGs在周边环境细菌中的流行，尤其是医学临床上关注的cfr和optrA基因。其次,采用Illumina HiSeq 2500高通量测序平台对土壤中FRGs的污染水平进行进一步验证,同时对与其水平转移相关的转座酶基因(1S6100, IS26, IS256,ISEnfa5,ISEnfa4和IS1216等)的reads数目也进行了统计并分析,与荧光定量PCR结果相似,HN-S-1、HN-S-2及HN-S-3中FRGs的整体污染水平较其他FFC使用年限较短的猪场样品中高。通过FRGs与转座酶基因的相关性分析发现,样品中FRGs与转座酶基因的含量呈显著正相关性(r2=0.9833,p<0.0001)。另外,宏基因组测序结果显示猪场土壤中还存在多种其他抗生素耐药基因的污染,包括氨基糖苷类、四环素类、大环内酯类等。而在细菌多样性分析试验中发现,经过动物排泄物灌溉的猪场土壤中的微生物种类及易携带FRGs的菌属所占比例均比空白土壤中多,推测FRGs可能借助于这些相关转座酶基因在土壤细菌中进行水平传播。第三,本研究采用FFC抗性平板在以pZE21-MCS1为载体所构建的土壤宏基因组文库中筛选到含有已知耐药基目floR、soxS、marA/R的克隆,均表现对FFC不同程度的耐药；同时还成功构建了含有204,000个克隆的fosmid宏基因组文库,通过FFC抗性筛选得到11株抗性克隆,对其中FFC的MIC值升高了16倍的2株进行序列分析及亚克隆文库筛选,但未发现任何FFC已知耐药基因或其变体,推测该连接片段中可能存在某种新弛耐药基因,需进一步研究确证。功能宏基因组文库的构建及筛选为挖掘抗生素耐药基因提供了有效的途径。综上所述,本文对猪场环境十壤中FRGs进行研究,揭示养猪场使用FFC斤会引起FRGs对十壤环境造成一定程度的污染,尤其是一些重要的FRGs,cfr和optrA基因。这些耐药基因是否会通过环境随食物链传递进入人体,进而会对食品安全和人类健康造成潜在危害需进一步研究。