背景和目的　　死亡时间(postmorteminterval，PMI)是指从死亡发生到尸体检验时所经过的时间，又称死后经过时间。PMI推断是各类死亡案件的法医学鉴定的重要内容之一，对于确定发案时间、划定侦查范围、案件重构等具有重要意义。但是，目前推断PMI仍主要综合地依据早期和晚期尸体现象，尚缺乏公认准确的定性定量仪器检测技术方法。已共识，可致全身性代谢功能变化的死因和尸体环境温度是影响PMI推断的两个最主要体内外因素。因此，本研究，结合不同温度环境下，大体和组织时序性自溶腐败的形态学变化，基于代谢组学理论和技术，利用GC-MS仪检测窒息死亡大鼠心、肝、脾、肾组织自溶腐败小分子降解产物的时序性变化规律，探讨推断PMI可行性。　　材料与方法　　清洁级成年SD大鼠(12±2周龄，300±20g)120只(汕头大学医学院动物中心提供)，雌雄不限，适应饲养3天，密闭橡胶囊封闭大鼠口鼻致捂死，记录窒息过程中动态心电、呼吸变化(BL-420F生物基础实验仪器)。死后立即整体放于人工气候箱中自然腐败(恒定湿度75%)，设置20℃、25℃、30℃和35℃4个温度组，每组分0h、24h、48h、72h、96h、120h共6个时间点，每个时间点各5只大鼠。按“六定”标准，规范取材，于相应时间点解剖体取心、肝、脾、肾等组织100mg，放置气候箱内固定于1ml75%乙醇溶液中3d，甲醇二次提取后，加正亮氨酸内标，吹干，置-80℃备检。甲氧胺肟化、MTBSTFA衍生化，GC-MS上机定性定量检测物质峰。同时，观察、拍照、记录整体外观、大体器官组织形态变化，并常规备制HE染色切片，组织学观察相应变化。　　采用SIMCA13.0.3处理后PLS-DA/OPLS-DA建模，分析代谢轮廓，NIST谱库匹配定性，内标峰面积定量，处理各组织代谢物数据，结果以均数±标准差表示，Kruskal-Wallis检验(P<0.05)，SPSS20.0线性回归和多元逐步回归分析，GraphPadPrism7.0绘制散点图。　　1、机械性窒息(捂死)模型建立　　捂死大鼠呈明显机械性窒息的电生理变化：心律先加快、电压先高，之后逐渐减慢、减低。呼吸先深大，后呼吸暂停，又恢复呼吸，呈周期性呼吸，最后呼吸停止，历时约5~6min，呈呼吸均先于心跳停止的脑死亡。整体观察表现为眼球突出，结膜淤血，唇舌粘膜发绀，鼻腔偶见出血，四肢皮肤发绀，呈经典的机械性窒息死亡过程。　　2、常规形态学观察　　大体变化：随时间延长，大鼠整体腐败膨胀逐渐加剧，各脏器组织表面光滑度下降，颗粒感增强，切面污秽瘫软加重。组织学变化：各组织随时间延长，腐败程度增加，组织表面逐渐由暗红色变为灰褐色，组织瘫软，间质逐渐疏松，结构逐渐模糊，细胞核逐渐溶解，细胞弥漫自溶，残存组织轮廓逐渐消失。各温度组总体上呈温度高比温度低的上述形态学变化快。　　3、GC-MS代谢组学分析　　不同温度组的OPLS-DA建模得出GC-MS代谢轮廓图：各组织代间谢轮廓界限明显、差异显著，提示温度是影响PMI推测的重要因素。不同温度组各器官组织PLS-DA建模，显示不同时间点间能大致分开，相邻时间点间偶见交叉。以VIP>1、Kruskal-Wallis检验(P<0.05)、SPSS线性回归R2>0.5为标准，筛选不同温度组各脏器与PMI重要关联的代谢物质如下：　　⑴心肌与PMI相关的代谢物及最优回归方程：　　①20℃组R2>0.50物质如下：L-丙氨酸甘氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、琥珀酸、L-谷氨酸、L-赖氨酸、亚油酸、花生四烯酸、L-酪氨酸。多元回归方程为：YPMI=12.61+265.2X甘氨酸－48.12X琥珀酸(R2=0.880，SE=14.94)。　　②25℃组R2>0.50物质如下：L-丙氨酸、L-缬氨酸、琥珀酸、L-谷氨酸、十六烯酸、十六烷酸(棕榈酸)、L-赖氨酸、十七烷酸、亚油酸、油酸、十八烷酸(硬脂酸)、花生四烯酸、二十二碳六烯酸。回归方程为：YPMI=4.635+128.0X油酸+30.46X丙氨酸(R2=0.945，SE=10.13)。　　③30℃组R2>0.50物质如下：丁酸、L-缬氨酸、尿素、苯丙酸、L-亮氨酸、琥珀酸、正缬氨酸、丙酸、L-谷氨酸、十六烷酸、L-赖氨酸、十八烷酸、二十二碳六烯酸。回归方程为：YPMI=45.52+60.03X缬氨酸－104.5X丁酸－13.48X亮氨酸(R2=0.955，SE=9.389)。　　④35℃组R2>0.50物质如下：丁酸、琥珀酸、L-天冬酰胺、十六烷酸、十七烷酸、亚油酸、十八烷酸。回归方程为：YPMI=－9.260+17.96X十八烷酸+28.61X亚油酸+20.40X丁酸－764.7X十七烷酸(R2=0.934，SE=11.52)。　　⑵肝脏与PMI相关的代谢物及最优回归方程：　　①20℃组R2>0.50物质如下：L-丙氨酸、甘氨酸、丙酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、琥珀酸、L-苏氨酸、磷酸、肌酸酐、L-蛋氨酸、环己烯-二甲酸、L-苯丙氨酸、肉豆蔻酸、L-谷氨酸、油酸、十六烷酸、L-赖氨酸、十七烷酸、亚油酸、十八烷酸、花生四烯酸、L-酪氨酸、二十二碳六烯酸。回归方程为：YPMI=17.65+362.9X环己烯-二甲酸(R2=0.755，SE=21.02)。　　②25℃组R2>0.50物质如下：L-丙氨酸、L-缬氨酸、琥珀酸、磷酸、肉豆蔻酸、L-谷氨酸、十六烷酸、L-赖氨酸、亚油酸、十八烷酸、花生四烯酸、L-酪氨酸、二十二碳六烯酸、胆固醇。回归方程为：YPMI=－0.776+223.7X二十二碳六烯酸+3.454X磷酸(R2=0.915，SE=12.80)。　　③30℃组R2>0.50物质如下：D-天门冬氨酸、氨基丙酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、琥珀酸、L-天门冬氨酸、正缬氨酸、酪胺、丙烯酸、L-谷氨酸、十六烷酸、L-赖氨酸、十八烷酸、L-组氨酸、花生四烯酸。回归方程为：YPMI=7.384+39.13X赖氨酸+5.172X十八烷酸(R2=0.939，SE=10.69)。　　④35℃组R2>0.50物质如下：L-脯氨酸、琥珀酸、磷酸、十六烷酸、亚油酸、异维甲酸、桐油酸、二十四烷酸。回归方程为：YPMI=－2.814+7.738X琥珀酸+680.2X二十四烷酸+1121X桐油酸(R2=0.902，SE=13.77)。　　⑶脾脏与PMI相关的代谢物及最优回归方程：　　①20℃组R2>0.50物质如下：乙醇胺、L-丙氨酸、甘氨酸、磷酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、琥珀酸、L-脯氨酸、乙酰天冬氨酸、L-苯丙氨酸、L-谷氨酸、十六烷酸、L-赖氨酸、十七烷酸、谷氨酰胺、亚油酸、十八烷酸、花生四烯酸。回归方程为：YPMI=－1.147+55.48X丙氨酸+145.8X花生四烯酸－40.29X赖氨酸(R2=0.875，SE=15.56)。　　②25℃组R2>0.50物质如下：乙醇胺、L-丙氨酸、亮氨酸、L-脯氨酸、L-赖氨酸、L-谷氨酸、磷酸、次黄嘌呤、L-苯丙氨酸、亚油酸、L-色氨酸、胆固醇。回归方程为：YPMI=2.138+15.54X谷氨酸＋123.2X脯氨酸(R2=0.886，SE=14.56)。　　③30℃组R2>0.50物质如下：二甲脲、D-天门冬氨酸、L-缬氨酸、尿素、苯丙酸、琥珀酸、正缬氨酸、丙烷、酪胺、丙酸、十六烷酸、L-赖氨酸、十八烷酸。回归方程为：YPMI=24.00－91.25X二甲脲+28.54X苯丙酸+14.71X十八烷酸+4.072X琥珀酸(R2=0.960，SE=8.962)。　　④35℃组R2>0.50物质如下：琥珀酸、乙酰天冬氨酸、十六烷酸、十七烷酸、亚油酸、十八烷酸、二十四烷酸。回归方程为：YPMI=－0.012+8.210X琥珀酸+6.311X十六烷酸(R2=0.745，SE=21.83)。　　⑷肾脏与PMI相关的代谢物及最优回归方程：　　①20℃组R2>0.50物质如下：L-缬氨酸、丁酸、琥珀酸、L-谷氨酸、花生四烯酸、L-色氨酸。回归方程为：YPMI=116.4+28.08X缬氨酸－45.67X丁酸(R2=0.908，SE=14.56)。　　②25℃组R2>0.50物质如下：L-丙氨酸、L-缬氨酸、异亮氨酸、琥珀酸、磷酸、L-脯氨酸、L-谷氨酸、十六烷酸、L-赖氨酸、十七烷酸、亚油酸、十八烷酸、花生四烯酸、L-色氨酸、胆固醇。回归方程为：YPMI=－12.34+18.54X十七烷酸+4.454X磷酸(R2=0.913，SE=12.28)。　　③30℃组R2>0.50物质如下：L-缬氨酸、苯丙酸、琥珀酸、正缬氨酸、丙烯酸、丙酸、十六烷酸、L-赖氨酸。回归方程为：YPMI=3.959+9.445X十六烷酸+15.85X缬氨酸+17.48X苯丙酸(R2=0.947，SE=10.09)。　　④35℃组R2>0.50物质如下：L-脯氨酸、琥珀酸、十六烷酸、十七烷酸、亚油酸、十八酸、鲨油酸、二十四烷酸。回归方程为：YPMI=－4.767+12.24X琥珀酸+786.5X十七烷酸(R2=0.820，SE=18.33)。　　1、捂死是法医鉴定中常见机械性窒息死因，本研究捂死大鼠呼吸变化呈窒息典型6期，心电表现呈2期。电生理检测显示呼吸、心电节律与传统描述的过程基本同步，本窒息模型造模成功。　　2、捂死大鼠在20℃、25℃、30℃、35℃条件下，心、肝、脾、肾组织降解产物包括氨基酸、有机酸、无机酸、脂肪等70种，其中与PMI相关性高的物质，共同明显的时序性变化的有11种；各器官特异性物质：心肌1种、肝脏9种、脾脏5种、肾脏2种。PLS-DA/OPLS-DA建模，排列筛选物质，多元逐步线性回归分析，可提高推断PMI的精确度和可信度。心肌的推断PMI多元回归方程最优。　　3、温度每上升5℃，物质平均生成速率约上升1.03-2.67倍，温度每升高10℃，物质生成速率约上升1.11-4.70倍。说明温度明显影响尸体组织物质降解速率。