目的：肌萎缩侧索硬化（amyotrophic lateral sclerosis,ALS）是一种运动神经元病，主要病理特点为选择性侵犯脊髓前角细胞、脑干运动神经元、皮质锥体细胞及锥体束。它是一种进展性、致命性的神经系统变性疾病，病人逐渐出现四肢无力，最后累及呼吸肌，多于发病3-5年内死亡。尽管经过了大量的努力，ALS的发病机制目前仍旧是未完全了解的，疾病潜在机制的阐明对制定有效的治疗措施是至关重要的。最近的研究证实内质网应激（endoplasmic reticulum stress, ERS）参与家族性ALS（familialALS；FALS）以及散发性ALS（sporadic ALS；SALS）的发病机制。当内质网腔中出现错误折叠蛋白的聚集或者钙离子循环紊乱时就会发生ERS。为了应对这种应激，细胞发生保护性反应，即未折叠蛋白反应（unfolded protein response；UPR）。UPR主要包括三个感受蛋白：转录激活因子6（activating transcription factor6；ATF6）、肌醇需求激酶1（inositolrequiring kinase1；IRE1）、双链RNA激活蛋白激酶样内质网激酶（double-stranded RNA-activated protein kinase-like endoplasmic reticulumkinase；PERK）。在正常生理情况下，ATF6、IRE1、PERK与内质网伴侣葡萄糖调节蛋白78（glucose regulated protein78；GRP78）又称为免疫球蛋白重链结合蛋白（binding immunoglobulin heavy chain protein；BIP）结合，处于无活性状态。当ERS发生时，三个感受蛋白与GRP78解离，激活下游的信号通路帮助内质网恢复稳态。如若稳态不能恢复，应激持续存在时，细胞就会发生凋亡。X盒结合蛋白1（X-box binding protein1;XBP-1）是ERS中一个重要的转录因子，ERS发生时，IRE1剪接XBP-1mRNA，剪接的XBP-1mRNA进入细胞核，上调分子伴侣等基因的表达来帮助恢复内质网稳态。研究发现，ERS保护剂Salubrinal，能够减轻ALS小鼠模型的临床表现，并能延缓疾病的进展。对ALS中ERS的研究为ALS发病机制的研究展开了新的一页。并有望为ALS的治疗提供新的观点。临床中大部分ALS是散发的，大约5-10%是家族性的。尽管SALS占大部分，但两者有着极其相似的临床表现，对FALS的研究于SALS发病机制的阐明也有很大帮助。FALS中约有20%是由突变的SOD1导致的。hSOD1^G93A转基因小鼠是目前公认的FALS研究动物模型。本实验研究ERS标记物XBP-1在不同时期hSOD1^G93A转基因小鼠腰髓中的表达变化。方法：1hSOD1^G93A转基因小鼠的繁殖和鉴定将B6SJL-Tg（SOD1-G93A）1Gur/J半合子雄鼠和B6SJL F1雌鼠配种，剪取子代小鼠尾尖，提取组织DNA进行PCR鉴定。鉴定结果中含有hSOD1基因的小鼠为hSOD1^G93A转基因小鼠，hSOD1基因阴性的小鼠为非转基因小鼠。2实验分组:将hSOD1^G93A转基因小鼠分为六组，每组3只，分别为出生后4周（28天）、5周（35天）、7周（49天）、9周（63天）、症状早期（约90天）、终末期（约120天）。其中前四组均为症状前期组。每组均设同性别、同年龄、同窝阴性对照。3观察不同时期hSOD1^G93A转基因小鼠腰髓中XBP-1的表达变化3.1Western-blot：将到时期小鼠麻醉、摘眼球放血，留取新鲜腰髓标本，并-80℃保存。提取固定总蛋白并测定蛋白浓度，聚丙烯酰胺凝胶电泳后转膜，5%脱脂奶粉封闭后加一抗4℃过夜。次日，TPBS洗膜后加二抗室温一小时，再次PBS清洗后扫膜仪扫膜，检测各组标本中XBP-1的表达情况。3.2免疫组织化学：将到时期小鼠麻醉，4%多聚甲醛固定，留取固定后腰髓并4%多聚甲醛浸泡。将固定好腰髓用振荡切片机切成25μm厚标本。PBS清洗切片后10%H2O2浸泡，再用0.3%TritonX-100打孔。用10%马血清室温封闭30分钟后加一抗4℃过夜。次日，PBS清洗后加二抗室温孵育2小时。然后加辣根酶标记链霉卵白素室温孵育1小时。最后进行常规DAB显色、脱水、中性树胶封片。在普通光学显微镜下观察XBP-1在腰髓前角运动神经元中的表达情况。3.3免疫荧光化学染色：将到时期小鼠麻醉，4%多聚甲醛固定，留取固定后腰髓并4%多聚甲醛浸泡。将固定好腰髓用振荡切片机切成25μm厚标本。用PBS清洗切片后浸泡在0.3%TritonX-100中室温打孔30分钟。用10%马血清室温封闭30分钟后加一抗4℃过夜。次日，PBS清洗后加二抗以及细胞核染料Hoechst室温孵育2小时。最后用抗荧光衰减淬灭剂封片。在共聚焦显微镜下观察XBP-1在腰髓前角运动神经元中的表达情况。4统计分析：将数据进行正态检验以及方差齐性检验，服从正态分布以及方差齐性者以均数±标准差（Χ±S）表示，采用SPSS17.0统计软件进行检验。统计结果以P<0.05为具有显著性差异。结果：1经PCR鉴定将小鼠分为hSOD1^G93A转基因小鼠和非转基因小鼠。2Western-blot、免疫组织化学、免疫荧光化学结果显示XBP-1在hSOD1^G93A转基因小鼠和非转基因小鼠中表达有差异。Western-blot结果显示：症状早期和终末期转基因小鼠组剪接的XBP-1均较非转基因小鼠组明显增多；各时期转基因小鼠组比较，剪接的XBP-1在症状早期和终末期增多，症状早期增多最显著；症状前期（28d、35d、49d、63d）转基因小鼠组和非转基因小鼠组比较无明显差距；各时期非转基因小鼠组比较无明显差距。症状早期和终末期转基因小鼠组未剪接的XBP-1均较非转基因小鼠组减少；症状前期（28d、35d、49d、63d）转基因组和非转基因组比较无明显差距；各时期非转基因小鼠组比较无明显差距。免疫组织化学和免疫荧光化学结果显示：症状早期和终末期转基因小鼠组腰髓前角运动神经元与非转基因小鼠组相比呈现明显的核着色；症状前期（28d、35d、49d、63d）转基因小鼠组与非转基因小鼠组腰髓前角运动神经元均未见明显核着色；终末期转基因小鼠组腰髓前角运动神经元数量明显减少，胞体明显皱缩。结论：XBP-1的剪接主要发生在hSOD1^G93A转基因小鼠发病早期和终末期；在症状前期hSOD1^G93A转基因小鼠中，未发现XBP-1发生明显改变；终末期运动神经元数量明显减少，胞体发生皱缩。ERS参与FALS小鼠模型hSOD1^G93A转基因小鼠的发病。