论文部分内容阅读
研究背景和目的:溶瘤病毒治疗已成为肿瘤治疗重要的辅助手段,研究表明溶瘤病毒家族的新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)抗瘤作用,不仅与NDV直接溶瘤有关,而且还与NDV激活免疫有关,且近年来对病毒活化免疫细胞抗肿瘤的研究越来越受重视。在NDV诱导的抗肿瘤免疫应答中,巨噬细胞起着重要作用。NDV不仅可以诱导巨噬细胞上调干扰素(interferon,IFN)、白介素6(interleukin-6,IL-6)等多种细胞因子表达,还可以诱导巨噬细胞上调肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)表达及一氧化氮(nitric oxide,NO)的释放,增强巨噬细胞对肿瘤细胞的杀伤效应。然而NDV如何活化巨噬细胞的具体机制并不清楚,有研究表明,维甲酸诱导基因I(retinoic acid induced gene I,RIG-I)是胞质溶胶中识别病毒RNA的传感元件,RIG-I识别病毒RNA后可触发起始信号级联反应,引起下游多种转录因子的激活。那么,RIG-I是否是NDV激活巨噬细胞上调抗瘤因子的活化途径尚未清楚,成为本课题研究的主要内容。我们拟采用RNA干扰技术沉默小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞株的RIG-I表达,研究其对NDV活化小鼠巨噬细胞TRAIL、TNF-α和IL-6的表达及NO释放的影响,为NDV抗肿瘤研究和临床治疗提供新思路。方法:1.NDV体外作用小鼠巨噬细胞株RAW264.7 12h,采用定量PCR(quantitative PCR,qPCR)法测定巨噬细胞的TRAIL、TNF-α和IL-6的mRNA相对含量,采用qPCR法和Western blot法分别测定RIG-I的mRNA和蛋白质的相对含量;收集NDV体外作用小鼠巨噬细胞株RAW264.7 12 h的细胞培养上清液,采用Griess法检测巨噬细胞释放的NO浓度。2.应用siRNA介导的瞬时转染法沉默小鼠巨噬细胞株RAW264.7的RIG-I基因,随后经NDV体外作用12 h后,采用qPCR法检测siRNA干扰对NDV活化的小鼠巨噬细胞株RAW264.7的RIG-I、TRAIL、TNF-α及IL-6的mRNA水平的影响;并收集NDV刺激12 h的细胞培养上清液,采用Griess法检测siRNA干扰对NDV活化的小鼠巨噬细胞株RAW264.7释放的NO浓度。结果:1.qPCR结果显示,与阴性对照(简称NC)组相比,NDV和紫外线处理的NDV(简称UV-NDV)的体外作用可以上调小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞株RIG-I、TRAIL、TNF-α和IL-6的mRNA相对表达量(p<0.05);Western blot结果显示,与NC组相比,NDV的体外作用可以上调RIG-I相对表达量(p<0.05);Griess法的结果显示,NDV和UV-NDV作用的RAW264.7细胞株细胞NO浓度显著高于NC对照组(p<0.01)。2.用siRNA-1101和siRNA-1943分别干扰巨噬细胞的RIG-I基因,干扰组RIG-I的mRNA相对含量均显著低于空白对照组(p<0.01);与未干扰组相比较,siRNA干扰处理后的NDV活化的巨噬细胞RIG-I、TRAIL和IL-6的mRNA相对表达量均显著下降,而TNF-α的mRNA相对表达量和NO的浓度未出现下降。结论:本研究利用RNA干扰技术沉默小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞株RIG-I基因的表达,围绕着RIG-I是NDV激活巨噬细胞上调抗瘤因子的活化途径开展研究,证实:1.NDV可促巨噬细胞上调参与杀伤肿瘤细胞的效应分子TRAIL、TNF-α和细胞因子IL-6的表达以及NO的产生,与此同时,NDV还可促巨噬细胞上调RIG-I的表达;2.RNAi沉默巨噬细胞RIG-I基因表达后,NDV活化的巨噬细胞TRAIL、IL-6的表达量下降,而TNF-α表达和NO释放量不受影响。因此,在NDV抗肿瘤的巨噬细胞免疫激活机制研究中,我们认为NDV能经由RIG-I途径激活巨噬细胞TRAIL、IL-6表达,RIG-I途径可能不是NDV活化巨噬细胞上调TNF-α表达及增加NO释放量的活化途径,这为NDV抗肿瘤研究和临床治疗提供新思路。