【摘 要】
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用EcoR I和Xba I双酶切pT-AD,回收载体上的AD基因,并将其克隆至甲醇毕赤氏酵母表达载体pPICZA中相应的位点上;转化E.coli Top10F,经鉴定获得重组表达载体pPICZA-AD.用BamH I
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用EcoR I和Xba I双酶切pT-AD,回收载体上的AD基因,并将其克隆至甲醇毕赤氏酵母表达载体pPICZ<,α>A中相应的位点上;转化E.coli Top10F,经鉴定获得重组表达载体pPICZ<,α>A-AD.用BamH I和Bgl II双酶切pPICZ<,α>A-AD,回收含Cecropin AD基因的1745 bp目的片段,并与用BamH I线性化的pPICZ<,α>A-AD连接,转化E.coli Top10F,经鉴定含 双拷贝Cecropin AD基因的重组表达载体pPICZ<,α>A-AD.取重组表达载体(pPICZ<,α>A-AD、pPICZ<,α>A-2AD)分别转化甲醇毕赤氏酵母GS115(his4),经Zepcin抗性筛选,获得重组 酵母菌株,经PCR扩增,点杂交检测主宰证实外源Ceocin AD基因已整合入酵母GS115(his4) 基因组中,将pPICZ<,α>A-AD、pPICZ<,α>A-2AD转化菌进行摇瓶发酵,表达产物浓缩后,Trince-SDS-聚丙烯酰胺胶电泳有一特异带,分子量约为6.97KD,用金属螯合新和膜纯化,获得抗菌肽融合蛋白,用E.coli K<,12>D<,31>为指示菌进行琼脂平板孔穴扩散法,活性蛋白 电泳检测,表达产物有抗菌活性.
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