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目的:本实验以先天性心脏病患者为研究对象,探讨基因NKX2.5和GATA4在先心病患者中的突变情况,尝试从分子水平研究先天性心脏病的发病原因。方法:使用PCR-DNA测序技术对26例散发性住院先心病患儿及其双亲的外周静脉血中NKX2.5和GATA4基因的全部外显子及其侧翼序列进行测序分析,检测其是否有突变。另外采用微阵列比较基因组杂交(Microarray Comparative Genomic Hybridization,array CGH)技术对一个先天性房间隔缺损家系(ASD)进行基因拷贝数变异(Copy Number Variation,CNV)的分析,同时采用PCR-DNA测序技术进行GATA4全部外显子的测序。结果:1对散发先心病患儿心脏发育相关基因NKX2.5的全部外显子测序分析(1)在9例先心病患者中发现编码21位氨基酸的第三个碱基(T→C,C/T)存在同义突变(E21E,E为谷氨酸),位于外显子1,检出率为34.6%(9/26),比对NCBI上的SNP库,证实是一个单核苷酸多态性(SNP)位点,此A→G(c.63A>G,-172662024)多态已被报导。(2)在1例先心病患者中发现第282位碱基(G/T)存在杂合同义突变(P94P,P为脯氨酸),检出率为0.04%(1/26),位于外显子1,c.282 A/C(-172661805)在NCBI的SNP库中未查到SNP,可能是一个新的单核苷酸多态性。(3)在6例先心病患者中发现第738位碱基(c.738A/T)存在杂合错义突变(N246K,由天冬酰胺突变为赖氨酸),检出率为19.2%(5/26),位于外显子2。(4)在1例先心病患者中发现两个杂合同义突变c.769C/G(P257P,P为脯氨酸)和c.780C/A(G260G,G为甘氨酸),检出率均为0.04%(1/26),位于外显子2,基因组序列上分别为(-172659778)和(-172659767),在NCBI的SNP库中未查到相应SNP。2对GATA4全部外显子的检测中,仅在1例先心病患者正向引物测序中发现第744位碱基测序是双峰(c.744C>T),而后经反向引物测序证实,属于同义突变(N248N,N为天冬酰胺),检出率为0.04%(1/26),位于外显子3,基因组序列上为(11606555),可能是一个新的单核苷酸多态性位点,需要进一步证实。3选择苏州市市立医院苏州(复旦)生命科学联合实验室提供的一个先天性房间隔缺损(ASD)家系的DNA样本。采用微阵列比较基因组杂交(array CGH)的方法进行CNV的分析,没有发现与疾病共分离的CNV。同时采用PCR-DNA测序技术对家系样本进行基因GATA4的测序。结果在家系子孙三代的四名房间隔缺损及肺动脉狭窄患者中发现了一个共同基因突变,第839位碱基C→T(即c.839C>T),患者均为T280M杂合子(由苏氨酸突变为甲硫氨酸),而在家系其他四名正常人DNA测序均为839C纯合,基因库中800例对照样本测序结果也均为839C纯合,说明这个突变位点是这个家系患者所特有的,有可能此基因突变导致先心病。结论:在对26例先心病患者进行NKX2.5和GATA4全部外显子的基因测序中,基因GATA4未发现错义突变,在NKX2.5外显子2的第一部分发现了一个错义突变,发现了NKX2.5上的4个SNP和GATA4上的1个SNP,这些基因突变及基因多态性可能与先心病发生有关,但确切的相关性有待进一步研究。在先天性房间隔缺损家系中检测到了GATA4的突变,这个突变在其他800例对照样本的SNapShot分型中均未发现,说明是此家系中所特有的突变,生物信息学研究表明该位点突变与该家系中发现的房间隔缺损有关。