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非洲爪蟾(Xenopus laevis)模型系统是一种重要的新基因功能研究平台。本研究利用RT-PCR的方法从非洲爪蟾卵母细胞总RNA中克隆得到了与人DRR1基因(human down-regulated in renal cell carcinoma，hDRR1)同源的cDNA片断，生物信息学分析结果表明该基因编码的蛋白与人和小鼠的同源蛋白具有高度的序列相似性，同源性分别为74％和66％，因此将爪蟾的这个基因定名为xDRR1(Xenopus DRR1)。将xDRR1基因克隆于真核表达质粒pEGFP-N1以及pcDNA3.1(+)，构建了表达载体pEGFP-N1／xDRR1和pcDNA3.1(+)／xDRR1。通过表达谱分析发现，xDRR1基因在爪蟾胚胎早期发育的不同阶段以及成体的各个组织中均有广泛表达。将表达载体pEGFP-N1／xDRR1转染人非小细胞肺腺癌细胞株A549细胞，亚细胞定位显示xDRR1基因编码一种核蛋白。xDRR1作为一种含有螺旋卷曲结构的核蛋白，提示它可能通过与其它蛋白或DNA的相互作用来参与基因的转录调控和信号转导。用表达载体pcDNA3.1(+)／xDRR1转染A549肺癌细胞，表明xDRR1对细胞的生长具有抑制作用。然而，应用反义技术抑制xDRR1基因的表达或显微注射相应的xDRR1 mRNA后并未观察到明显的发育异常表型。人的DRR1基因广泛表达于正常的组织中，但在体外培养肿瘤细胞或者原发性肿瘤中期表达通常被下调。我们通过原核表达载体pQE30在大肠杆菌中对DRR1进行了表达。结果发现融合有6个组氨酸(6xHis)的重组蛋白的可溶性具有温度依赖性的。在37℃诱导表达时，重组DRR1蛋白(recombinant DRR1，rDRR1)以可溶性和非可溶性两种形式存在，其中可溶性蛋白占到重组蛋白的80％左右；当在20℃诱导时，rDRR1蛋白几乎完全以可溶性的形式表达。通过Ni-NTA树脂对20℃诱导表达的rDRR1蛋白在非变性条件下进行了纯化，并对纯化所得到的蛋白进行了电喷雾电离质谱(electrospray ionization-mass spectrometry，ESI-MS)鉴定。rDRR1蛋白进一步被用来制备多克隆抗体，该抗体能够识别外源性表达的DRR1蛋白以及培养细胞或者组织中的内源性DRR1蛋白。大量纯化的DRR1蛋白及其抗体取得为DRR1的功能研究提供了有力的工具。背景：肿瘤的发生发展是多因素、多步骤的过程，细胞的无限增殖和凋亡受抑是两个不可忽视的主要原因。PLK1(polo-like kinase 1)是一种高度保守的丝氨酸／苏氨酸激酶，对细胞的有丝分裂活动起着十分重要的作用。PLK1在人类的大多数肿瘤类型中均呈现出高表达状态，因而已经成为当前抗肿瘤研究热门靶点之一。小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)可以快速、高效的促使体内特定基因mRNA降解，实现基因转录后沉默(post-transcriptional gene silencing, PTGS)。应用RNAi技术阻断细胞周期促进基因或凋亡抑制基因功能是当前抗肿瘤生物治疗的一种新策略。目前临床上广泛采用的化学治疗(包括单药和多药联合化疗)在取得良好的抗肿瘤疗效的同时也可能产生严重的毒副作用，使得部分患者的生活质量降低。肿瘤的生物治疗作为一种辅助性治疗，可以在一定程度上增强其他治疗手段的疗效，改善患者的预后。因此，生物化疗是肿瘤综合治疗的一种发展趋势。目的：寻找对恶性肿瘤生长具有抑制作用的载体介导的PLK1-shRNAs；探讨PLK1-shRNA与吉西他滨联合治疗给小细胞肺癌的效果，为PLK1-shRNA基因治疗与化疗联合治疗恶性实体肿瘤提供依据。方法与结果：构建了3种针对PLK1基因的siRNA表达质粒(pGPU6／PLK1-184、pGPU6／PLK1-1412以及pGPU6／PLK1-1424)。转染体外培养的人肺腺癌A549细胞后通过RT-PCR检测发现，细胞内PLK1 mRNA的水平在PLK1-shRNAs，表达后明显降低；Western blot分析也证明了随着PLK1 mRNA的减少，细胞内PLK1蛋白表达水平也出现了相应改变；细胞增殖分析(MTS)结果表明PLK1基因的沉默能够能够引起细胞增殖活性降低；流式细胞分析提示PLK1基因受到阻抑后细胞的凋亡增加。体外实验结果说明这3种PLK1-shRNAs质粒表达后均能阻断PLK1基因的功能。建立了小鼠(BALB／cA-nu)的人肺癌肿瘤模型，将表达质粒pGPU6／PLK1-184、pGPU6／PLK1-1412以及pGPU6／PLK1-1424分别使用脂质体包裹后通过尾静脉给药对荷瘤小鼠进行治疗，结果发现与阴性对照(pGPU6／NC)相比，3种PLK1-shRNAs对异种移植肺癌的生长有抑制作用。免疫组化染色和组织原位凋亡检测(TUNEL)显示，治疗后体内肿瘤的生长抑制伴随着PLK1蛋白减少和凋亡细胞的增加。这些结果表明PLK1基因特异性的shRNAs具有抗肿瘤生物治疗的潜力。进一步研究发现，PLK1-shRNAs在体外能够增强吉西他滨对体外培养的肺癌A549细胞的毒杀作用，肿瘤细胞的凋亡在联合处理后有加强的趋势。动物实验结果表明，PLK1-shRNAs与吉西他滨的联合治疗的抗肿瘤效果优于二者分别单独进行的治疗。结论：载体介导的PLK1-shRNAs能特异抑制肿瘤细胞PLK1基因的功能并导致细胞的凋亡，进而对肿瘤的生长产生抑制效应。PLK1-shRNAs基因的表达不仅可诱导肿瘤细胞的周期阻滞和凋亡，而且还能使肿瘤细胞对以促进DNA损伤的化疗药物吉西他滨的敏感性增强，这为其应用于肺癌的生物化疗提供了实验上的支持。