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恶性肿瘤是严重威胁我国居民健康的重大疾病。近年来,随着精准医学的不断发展,肿瘤的诊治模式已发生了翻天覆地的变化,肿瘤患者的临床获益也取得了令人鼓舞的提高。以EGFR敏感突变的非小细胞肺癌(Non-small cell lung carcinoma,NSCLC)以例,相比于传统的化学治疗,经EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)治疗的无进展生存时间(PFS)已由过去的6个月提高至近20个月。然而即便TKI药物的有效反应率已高达70%,但随着治疗时间的延长,仍不可避免地发生耐药性的问题。及早发现耐药并及时更换治疗方案已成为提升肿瘤患者生存的关键。现有方法与资料表明,目前临床上TKI药物耐药性检测方法的灵敏度较低(1%左右),同时对样本需求量高(穿刺样本量通常不高),已不满足部分特殊病患的需求。一种多重、灵敏、便捷的耐药性检测方法能够提前及时发现耐药性,对于用药指导以及预后具有很高的临床意义。因此耐药性检测方法仍是一个急需解决的临床难题。根据耐药性的分子机制进行后续针对性治疗是精准医疗的重要内容,然而耐药性发生后的分子变异是相当复杂的。现仍有15-30%病例的TKI耐药机制尚不清楚。先前的研究表明AKT信号通路的过度激活是细胞对TKI药物耐受的关键因素。因此我们认为在药物的选择作用下癌基因或抑癌基因的过度激活或异常关闭可能是导致药物产生耐受性的关键。为了进一步证实我们的假设,我们拟对TKI耐药细胞中的基因表达做进一步分析,并深入了解关键性基因表达差异在信号通路传导中的作用,以及其对肿瘤细胞增殖、凋亡等影响。尽管吉非替尼在肿瘤细胞系中的耐药性研究已有部分报导,但均未涉及真实样本,本研究拟结合肿瘤患者TKI耐药后的原代肿瘤细胞研究TKI耐药性分子机制,并探讨联合其它化合物对TKI耐药性的影响。本论文从耐药性检测方法与耐药性分子机制两个方面,共分三个部分进行研究与探讨。第一部分自环扩增多重检测法在EGFR-TKI耐药性检测中的应用肿瘤耐药性突变检测对于肿瘤靶向治疗具有重要的指导作用。检测通量与检测灵敏度一直制约着耐药性基因突变检测的临床应用,特别是基于血浆游离DNA(cell free DNA,cf DNA)的基因突变检测。为切实提高cf DNA检测通量及灵敏度,本实验建立一种灵敏、便捷的自环扩增多重检测方法(MPRP技术)对肿瘤患者cf DNA进行无创性突变检测,并针对临床样本进行应用价值研究。结合锁式探针技术与滚环扩增技术,本实验利用HiFi DNA连接酶对单碱基因变异的识别能力,将锁式探针在与模板匹配后自连成环。通过滚环扩增对已成环的探针进行富集后,利用定量PCR进行多重突变检测。优化体系后,在多重定量PCR反应中使用一对通用引物与多条标记有不同荧光基团的荧光探针来实现多重检测。为探究MPRP技术在临床肿瘤相关突变检测中的应用,本研究收集8例非小细胞肺癌患者的血浆,并利用MPRP技术与数字PCR检测耐药性突变。两种平台的检测结果较为一致,这进一步证明自环扩增多重检测方法的临床价值。通过MPRP方法,可为肿瘤分子分型、临床用药、耐药研究提供强有力的工具。第二部分基于原代肿瘤细胞的EGFR-TKI耐药分子机制研究由于肿瘤靶向药物主要通过阻断信号通路、促使细胞凋亡等方式来抑制肿瘤细胞的生成,同时肿瘤细胞的耐药与细胞凋亡有密切关系,因此我们拟通过探讨凋亡与耐药的信号通路及关键基因之间的关系,为解开耐药机制提供新的思路。为进一步探索TKI药物耐药性的具体分子机制,本研究对2例已知驱动基因突变阴性的EGFR-TKI耐药的NSCLC患者的原代肿瘤细胞、PC-9/GR细胞株以及3株TKI敏感细胞系进行基因表达芯片分析,以研究TKI耐药与不同信号通路相关基因表达差异之间的关系。结合数据库信号通路筛选结果以及后续验证发现,FGFR1蛋白表达在TKI耐药细胞中显著上调,初步表明FGFR1表达水平的增加可能与TKI耐药性密切相关。为了研究FGFR1的表达增加是否与EGFR-TKI耐药直接相关,我们在TKI敏感的细胞系PC-9中过度表达FGFR1,用TKIs处理细胞并进行细胞存活和凋亡检测,以研究FGFR1的基因上调是否导致非小细胞肺癌细胞对TKI的耐药性。结果发现FGFR1过度表达减弱了吉非替尼诱导的生长抑制效应。同时,FGFR1的过度表达显著遏制了PC-9细胞受吉非替尼诱导的细胞凋亡,促进了细胞TKI耐药性的发展。在PC-9/GR细胞中转染FGFR1-siRNA载体后进行细胞生长抑制试验,发现FGFR1沉默显著抑制了细胞增殖。FGFR1可能不仅在PC-9/GR细胞的增殖、凋亡抑制中起重要作用,也介导了PC-9/GR细胞对吉非替尼的抗性。FGFR1可能通过激活Akt信号通路,诱导TKI耐药。第三部分FGFR抑制剂PRN1371联合吉非替尼抑制EGFR-TKI耐药细胞的生长FGFR1的过表达激活了AKT信号通路,从而促进癌细胞增殖,形成耐药性。但是使用FGFR1抑制剂能否增强吉非替尼对TKI耐药细胞的敏感性尚不清楚。为验证FGFR1抑制剂在EGFR-TKI敏感细胞株PC-9、TKI耐药细胞PC-9/GR以及TKI耐药患者的肿瘤原代细胞中药物效应,我们联合吉非替尼与FGFR抑制剂对细胞的凋亡、增殖等情况进行观察,从而进一步揭示TKI耐药机制。结果发现FGFR抑制剂PRN1371在PC-9/GR耐药细胞中能够显著抑制FGFR1 mRNA表达水平。吉非替尼与PRN1371联合应用显著抑制PC-9/GR耐药细胞的细胞活力、侵袭与迁移。因此,吉非替尼与PRN1371联合应用可协同抑制非小细胞肺癌中吉非替尼耐药细胞的增殖,可能是一种解决TKI耐药的治疗策略。