血吸虫病是一种严重危害人体健康的人畜共患寄生虫病。目前在全世界范围内,约有74个国家和地区的7.79亿人口受到血吸虫感染的威胁,有近2亿人感染血吸虫。寄生于人体的血吸虫有6种,在中国流行的是日本血吸虫病。血吸虫感染具有“伴随免疫”的特点,当感染者体内的血吸虫虫体被清除不久后,机体即丧失对血吸虫感染的免疫力。疫区人群或动物因反复接触疫水可引起血吸虫的不断再感染。发展有效的血吸虫病诊断方法,发现并消灭传染源是控制血吸虫病流行,消除其对人类健康危害的关键。目前血吸虫病常用的实验诊断方法有三种,一是基于粪便检查的病原学诊断;二是基于抗体或抗原检测的血清学诊断;三是基于核酸检测的分子生物学检测方法。经过六十多年的有效防治,目前我国的血吸虫病流行呈现低感染度、低感染率的特点。常用病原学检查方法(Kat o Katz法,毛蚴孵化法)不易检出轻度感染的病人,加之易感人群对粪便检查的依从性差,病原学方法的实用价值受到限制。检测核酸的分子生物学方法,如PCR, LAMP等虽然敏感性高、特异性好,但是需要使用贵重的仪器设备、苛刻的实验条件及熟练的技术人员,无法在现场推广应用。相比之下,血清学方法正被广泛应用,包括间接血凝(IHA),环卵沉淀法(COPT),酶联免疫吸附法(ELISA),免疫层析法等等,这些方法均是检测抗体IgG。由于治疗后IgG能在体内存留的时间较长,抗体阳性只能提供病人有感染史的信息,不能反映体内虫荷的真实情况。现有的抗体检测方法使用的抗原均为粗制可溶性虫卵抗原,易与其他非特异性抗体反应而导致假阳性或交叉反应。因此,抗体检测方法不能对血吸虫现症感染进行确诊与疗效考核。循环抗原是寄生于宿主体内的成虫分泌或排泄的抗原性物质(亦称排泄分泌抗原),存在于宿主血液、唾液、尿液等体液中。检测患者血清或尿液中的循环抗原不仅具有对现症感染进行确诊的价值,还可评估体内的虫荷量。由于治疗后患者血液中循环抗原转阴较快,检测循环抗原可以作为疗效考核的依据。Deelde等认为血吸虫循环抗原一般可以分为：膜相关抗原(MAA)、肠相关抗原(GAA)和虫卵可溶性抗原(SEA)。对感染后宿主体内循环抗原的动态变化研究表明,这三类循环抗原在感染后第10周左右才达到高峰,但感染早期以GAA为主,MAA和SEA在治疗后较GAA消失快,具有较好的疗效考核价值。然而血吸虫循环抗原在血液中以微量形式存在,检测方法的敏感性取决于被检测靶标分子在血清中的含量及检测系统的灵敏感性。目前血吸虫循环抗原检测方法的敏感性普遍较低,难以满足当前低感染度、低流行度状态下的血吸虫病诊断与流行病学调查的需求。血吸虫成虫排泄分泌抗原(ESA)是循环抗原的主要来源,但是,ESA成分较为复杂,各成分含量差异显著。对ESA组成成分进行分析,选择其中高丰度抗原作为检测靶标,是提高循环抗原检测方法敏感性的有效策略。本研究采用二维电泳和蛋白质质谱分析方法对日本血吸虫的成虫排泄分泌物中的蛋白质组成进行了分析确定了日本血吸虫烯醇化酶(Sj Enolase)是成虫排泄分泌物中含量最高的蛋白质。为建立高敏感性的对血吸虫现症感染具有确诊与疗效考核价值的检测循环抗原的血吸虫病免疫学诊断方法,本研究采用基因工程技术制备了纯化的重组烯醇化酶,制备了抗烯醇化酶的特异性单克隆抗体和多克隆抗体。建立了以抗烯醇化酶的特异性单克隆抗体为抗原捕获抗体,以抗烯醇化酶的特异性多克隆抗体为抗原检测抗体的双抗体夹心ELISA(亦称为Sj Enolase Sandwich ELISA),优化了双抗夹心ELISA的检测体系。对血吸虫感染家兔血清中Sj Enolase动力学进行了分析,并对该方法用于血吸虫低感染度患者的诊断与疗效考核的价值进行了初步分析。第一章：日本血吸虫排泄分泌物中高丰度循环抗原的鉴定、Sj Enolase蛋白的重组表达与特性分析一)日本血吸虫成虫排泄分泌物中高丰度蛋白分子的鉴定制备日本血吸虫成虫排泄分泌物(ESA),进行二维电泳分析,数字扫描考马斯亮兰染色的SDS-PAGE)疑胶,对蛋白斑点进行编号。用切胶仪从胶上切下单个的蛋白质斑点,进行酶解。所有酶解蛋白样品用ABI 4700 MALDI-TOF质谱仪进行分析,所获光谱数据在全球蛋白服务工作站(Globa 1Protein ServerW orkstation, GPS)上进行处理和分析,与NCB Inr蛋白数据库中蛋白数据进行比对搜索,鉴定GPS可信区间>95%的蛋白斑点。质谱分析的结果显示ESA中有76种蛋白来源于血吸虫,含量高的蛋白分子包括：2-二磷酸甘油酸脱水酶(烯醇化酶Sj Enolase)、70 kDa热休克蛋白(HSP70)、果糖二磷酸醛缩酶、三磷酸甘油醛脱氢酶、磷酸甘油酸激酶、谷胱甘肽转移酶、抑免蛋白、硫氧还蛋白过氧化物酶、14-3-3蛋白、PKA二型调节亚单位等。其中,Sj Enolase是ESA中含量最丰富的蛋白分子,是高丰度循环抗原分子之一。二)Sj Enolase基因克隆、表达、纯化与特性分析采用mRNA纯化试剂盒制备了日本血吸虫成虫的mRNA,反转录合成第一链cDNAo根据Genbank中烯醇化酶分子的编码序列(登录号为gi46201125),设计合戎引物,并在上游引物的5,端、下游引物的3’端分别引入限制性酶切位点BamHI、 SalI序列。采用phusion高保真DNA聚合酶从日本血吸虫成虫cDNA中扩增编码SjEnolase的DNA片段。然后,克隆到克隆TA载体pGEM-T (Promega公司产品)中构建重组质粒pGEMT-Sj Enolase。通过限制性酶切分析及DNA测序,确定重组质粒中插入DNA片段序列的正确性。然后,将目的片段通过BamHI, SalI位点亚克隆到表达质粒pET28a(+)载体,构建重组表达质粒pET28a-Sj Enolase。将重组质粒转化入E. coliBL21感受态细胞后,转种到含有卡那霉素(50 μg/mL)的LB平板上,选泽含有重组表达质粒的转化子。在不同的温度下培养转化子细菌,用IPTG进行诱导,表达重组Sj Enolase (rSj Enolase)蛋白。收集细菌沉淀物,经SDS-PAGE分析。结果显示当细菌生长到静止生期(OD600=2.4)在18℃,用0.1 mM的IPTG诱导,表达产物中含有一条50kDa左右的可溶性rSj Enolase蛋白条带。大量制备rSj Enolase蛋白的表达产物,经镍亲层析柱亲和层析法制备纯化的rSj Enolaseo以rSj Enolase蛋白福氏佐剂抗原免疫5只ICR小鼠,获得效价高于1：10,000的鼠抗Sj Enolase抗血清,表明rSj Enolase具有强烈的免疫原性。免疫印渍结果显示抗SjEnolase抗血清可以识别成虫抗原中天然的Sj Enolase蛋白,重组蛋白可以被日本血吸虫病人血清,重感染兔、鼠血清所识别,但不能被健康人、健康兔、健康鼠血清及毕支睾吸虫病人血清所识别,表明rSj Enolase具有天然免疫原性和免疫反应性,具有较好的免疫诊断潜能。第二章抗Sj Enolase抗体的制备与特性分析一)抗Sj Enolase蛋白多克隆抗体的制备以纯化的rSj Enolase蛋白完全福氏佐剂抗原免疫日本大耳兔蛋白用量为2 mg。加强免疫用不完全福氏佐剂抗原,蛋白用量相同。连续加强免疫3次,免疫间隔时间为2周。第4次免疫后1周经腹腔直接注射2 mg的Sj Enolase蛋白。一周后,经颈动脉采血,分离血清。以rSj Enolase蛋白包被酶标板,采用常规ELISA去测定血清中抗rSj Enolase抗体IgG效价。获得效价高于1：200,000的抗血清。通过Protein G亲和层析法从免疫血清中制备出纯化的抗rSj Enolase多克隆抗体IgG。非竞争ELISA险测结果显示抗rSj Enolase多克隆抗体的亲和常数达到2.7×108mol/l。二)抗Sj Enolase单克隆抗体制备及特异性分析取8周龄雌性BALB/c小鼠,用rSj Enolase蛋白福氏完全佐剂抗原进行免疫,抗原用量为50 μg/只。加强免疫为不完全福氏佐剂抗原,抗原用量相同,连续加强免疫3次。第四次免疫后1w,再用相同剂量抗原蛋白经腹腔注射加强免疫1次。制备免疫小鼠的单个脾细胞,与对数生长期SP2/0细胞按6：1的比例混合后,在含HAT的RPMI1640完全培养基中筛选杂交瘤细胞。以rSj Enolase包被酶标板,采用常规ELISA法筛选有抗rSj Enolase抗体分泌的杂交瘤细胞孔。对阳性孔细胞采用有限稀释法进行亚克隆,直至100%的细胞孔上清液均为阳性,并建立细胞株保存。最终获得5株能稳定高效分泌抗rSj Enolase蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为13G8、13A3、11F6、4G3、和1G9,抗体亚型分别为IgG1、IgG1、IgG2a、IgG1和IgG2b,细胞培养上清液中抗体效价分别为1：200,000,1：120,000,1：100,000,1：150,000,1：100,000。分别将分泌抗rSj Enolase单克隆抗体的杂交瘤细胞13G8、4G3接种雌性BALB/c小鼠腹腔,收集腹水,腹水中抗rSj Enolase抗体的效价均达到1：204,800以上。采用Protein G亲和层析法纯化腹水中抗rSj Enolase单克隆抗体。非竞争ELISA去测定单抗的亲和常数,结果显示单抗13G8、4G3的亲和常数分别为8.2×107 mol/l,4.87×107 mol/l。免疫印渍分析结果显示13G8不仅能识别rSj Enolase蛋白,还能特异性识别SEA, AWA和AWA中的天然Sj Enolase蛋白,但与大肠埃希菌蛋白和华支睾吸虫蛋白无交叉反应,这表明单克隆抗体13G8具有高度的特异性。第三章检测Sj Enolase双抗夹心ELISA的建立与优化分别以纯化的鼠抗rSj Enolase单抗为抗原捕获抗体或检测抗体,以纯化的免抗rSj Enolase多抗为抗原检测抗体或捕获抗体,以HRP标记的羊抗免IgG或HRP标记的羊抗鼠IgG为检测二抗,以单组分3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB)为底物进行显色,建立双抗体夹心酶联免疫吸附检测循环抗原Sj Enolase的方法(简称为Sj Enolase sandwich ELISA)。按照棋盘格方阵的方法,确定双抗体夹心ELISA的捕捉抗体与检测抗体的最佳配对及最佳工作浓度。在此基础上,用相同的方法分别对捕获抗体的包被条件、捕获抗体与抗原反应条件,抗原与检测抗体的反应条件,酶结合物的反应条件、底物显色条件进行优化。最后获得最佳检测体系和检测条件如下：反应体系为100μL,捕捉抗体为鼠抗Sj Enolase特异性单克隆抗体13G8,其最佳包被浓度为6.25 μg/mL,最佳检测抗体为兔抗Sj Enolase多克隆抗体IgG,其最合适的工作浓度为1.25 μg/mL。最佳检测条件为：包被抗体的酶标板在4℃过夜,用含5%胶脂奶粉PBS在37℃封闭1h;用PBST洗板(含0.05%的Tween-20)洗板3次,加入循环抗原溶液或血清样本100μL,37。C保温2h;洗板3次,加入检测抗体,37。C保温1h;再洗板3次,加入1：10000稀释的HRP标记的羊抗兔IgG,37。C保温1h;洗板3次,加入底物TMB 50μL,室温下显色10 min：加入50μL2M的硫酸终止反应。用酶标仪测定每孔的OD450值。阳性判断阈值为不加rSj Enolae蛋白的对照孔OD450值的2.1倍(0.192)。该方法检测rSj Enolae蛋白的最低检测限为700pg/mL,线性范围为0.7-1000ng/mL。第四章Sj Enolase在感染动物体内的动态变化及其血吸虫病临床诊断与疗效考核价值以抗Sj Enolase特异性单抗为检测抗体,采用Dot-ELISA方法观察同一家免感染前、感染后及吡喹酮治疗后不同间点的兔血清中循环抗原Sj Enolase含量的动态变化。结果显示,感染前家兔血清中Sj Enolase均为阴性,但随着感染时间的延长,未台疗组家免血清中Sj Enolase的含量逐渐升高,直至实验结束时(感染后第18 w)仍维持较高水平;治疗组家兔经吡喹酮治疗后血清中Sj Enolase迅速下降,在感染后12-16 w已接近阴性水平。Sj Enolase sandwich ELISA检测结果与Dot-ELISA结果相以。这表明家兔血清中Sj Enolase与血吸虫感染有关。用检测Sj Enolase的Sj Enolase Sandwich ELISA及检测抗SEA抗体IgG的SEAELISA对血吸虫病人血清(包括45份同一病人治疗前、治疗后不同时间点的配对血清),肝吸虫病人血清、肺吸虫病人血清及健康人血清同时进行检测。通过计算ROC曲线下面积确定判断阈值(cut-off value)。计算两种方法的敏感性(SE)、特异性(SP)、阳性预测值(PPV)、阴性预测值(NPV)和约登指数,并观察治愈后患者血清中Sj Enolase及抗SEA抗体IgG的阴转情况,考察该方法的诊断及疗效考核价值。结果显不,143份皿吸虫病人皿清经Sj Enolase Sandwich ELISA检测有120份为阳性,96份健康人血清有92份为阴性,方法的敏感性为84.61%,特异性为95.83%;约登指数为0.8。阳性预测值(PPV)、阴性预测值(NPV)分别为95.31%和86.17%。对45例治疗前粪检阳性患者、及同一患者在治疗后3月、6月、9月、12月的配对血清进行连续监测,治疗前阳性率为89.58%,治疗后3个月转阴率为93.33%,治疗舌6个月转阴率97.78%治疗后9、12个月转阴率均为100.00%。病人血清中Sj Enolase的含量与感染度呈正相关。这些结果表明,经过有效的治疗,病人血清中的循环抗原随着虫体的清除而迅速消失,检测循环抗原Sj Enolase具有重要的血吸虫病诊断与疗效考核价值。采用Sj Enolase Sandwich ELISA检测30份肝吸虫病人血清,只有1份阳性,交叉反应率为3.33%;20份卫氏并殖吸虫感染者血清中,只有1份阳性,交叉反应率为5%。采用SEA-ELISA检测同批次45患者治疗前后血清,治疗前阳性率为95.56%,治疗后3月、6月、9月、12月的转阴率分别为28.89%,28.89%,37.78%和42.22%。SEA ELISA与肝吸虫病人血清的交叉反应率为16,67%,与肺吸虫病人血清的交叉反应率为65%。结论本研究证实Sj Enolase是血吸虫排泄分泌抗原中含量最高的蛋白质分子,是血吸虫高丰度循环抗原之一。本研究建立的检测Sj Enolase的双抗体夹心ELISA (Sj Enolase Sandwich ELISA)用于低度感染血吸虫患者的诊断具有高度的敏感性与特异性,其检测结果能反应血吸虫病患者的感染度,并可用于评估治疗效果。该方法将有望弥补当前低度流行状态下血吸虫病防治工作中缺少有效诊断方法的不足。