结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)是结核病最主要的致病菌,机体感染后,经呼吸道、消化道在体内扩散,侵犯肺、肾及神经等其他组织器官,引发活动性结核病,具有较强的传染性和致病性;或者,在体内长期潜伏形成潜伏性结核感染(latent tuberculosis infection,LTBI)。每年结核病新发人数超过千万,而因结核病死亡的人数约在140-160万之间,覆盖整个年龄层和所有地区,引起国内外的高度关注。近年来,多种抗生素药物的使用,人口的全球性流动和HIV的流行,给结核病诊断与治疗带来新的危机。目前,全球有许多实验室正在致力于从基因组上全面解析结核分枝杆菌的发病机制及在体内的存活规律,为诊断和治疗结核病提供新的思路和技术手段。本研究使用结核分枝杆菌H37Ra构建转座突变库,从转座突变库中筛选生物膜突变体,定位相关基因,并分析生物膜相关基因,为本实验室结核分枝杆菌分子机制的深入研究奠定基础,同时提供一种有效方便的筛选结核分枝杆菌生物膜突变体的模型和多个宝贵的生物膜突变体材料,有助于了解结核分枝杆菌生物膜形成的遗传机制。1结核分枝杆菌H37Ra转座突变库的建立结核分枝杆菌H37Ra转座突变库的建立为实验室提供一种慢速生长分枝杆菌基因功能研究的手段。利用耻垢分枝杆菌大量扩增噬菌体,分别在30℃和37℃培养温度下筛选具有温敏特性的ΦMycoMarT7噬菌体,通过不断纯化温敏型噬菌体,提高其效价至1×1011 pfu/mL,利用携带Himar1转座子的温敏型噬菌体转导H37Ra,设置不同菌液稀释度,涂布在Kan抗性7H10平板上,37℃培养4周,至出现单菌落,选择特异性高的引物3,进行PCR鉴定。建立了适用于本实验室的结核分枝杆菌转座突变库的构建流程,提高温敏型噬菌体转导H37Ra的效率和突变库构建的效果。通过该流程进行构建,孵育菌液经5倍稀释后涂板培养,统计结果表明:构建的转座突变库容量为35,800,转导效率为7.96×10-6。2结核分枝杆菌生物膜相关基因的筛选与分析生物膜对于结核分枝杆菌在胞内存活、抗逆能力和耐药性方面具有重要意义。本研究以生物膜形成能力为H37Ra转座突变库的筛选方向,使用不同培养基、不同培养方式和生物膜测定方法,对H37Ra突变体生物膜形成进行测定,建立H37Ra生物膜突变体的筛选模型,选择7H9加Tween-80的液体培养基,在前两周密封静置培养,振荡混匀,随后在微氧环境中培养,以H37Ra作为对照直接观察转座突变体生物膜形成情况,按时记录。扩大培养生物膜形成能力不同的突变体,利用CTAB法提取全基因组,通过Tn-seq定位转座子的插入位点。目前,筛选891株突变体,其中筛选生物膜形成能力不同的突变体共28株,NGS定位突变位点21个,涉及13个相关基因。将其中影响生物膜形成的10个基因进行分析,与H37Rv基因组同源比对,并利用数据库比对分析,结果显示影响生物膜形成的基因主要分为中间代谢和呼吸相关基因、细胞壁和细胞过程相关基因、脂质代谢相关基因、保守假定蛋白编码基因,与结核分枝杆菌抗氧化压力,脂质合成和抗生素抗性有关,表明结核分枝杆菌生物膜形成表型与基因型之间的关系,为结核分枝杆菌生物膜的研究提供了宝贵的突变体材料。最后,构建重组耻垢分枝杆菌初步验证Rv3099c与生物膜的相关性,结果证实该基因表达对分枝杆菌生物膜生长具有一定促进作用。