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第一部分右美托咪定对脓毒症小鼠生存率的影响及肝脏保护作用目的:观察右美托咪定（DEX）对盲肠结扎穿刺法（CLP）建模下脓毒症小鼠生存、炎症反应和急性肝损伤的影响。方法:105只雄性C57BL/6小鼠随机分为以下组:（i）假手术组（CON）;（ii）CLP诱导肝损伤+生理盐水组（CLP）;（iii）CLP诱导肝损伤+DEX组（CLP+DEX）。采用CLP法建立小鼠脓毒症性肝损伤模型。术后0、2、4 h（小时）腹腔注射DEX 20μg/kg或等量生理盐水。观察小鼠术后状态并计算小鼠120小时死亡率。取CLP诱导脓毒症后6、12和24 h的小鼠肝脏标本和血液标本行进一步研究。苏木精伊红染色法（HE）检测各组小鼠肝组织的形态学变化。CLP术后6、12和24 h分别测定各组小鼠血清肝损伤标志物血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）和炎性细胞因子（肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-1β、IL-6和IL-10）水平。结果:1.CLP建模后CON组小鼠存活率为100%;CLP组和CLP+DEX组在12 h组的存活率分别为81%和100%,24 h的存活率分别为58.1%和83.8%。CLP组小鼠5天存活率为3.2%,CLP+DEX组小鼠5天存活率为12.9%。CLP组与CLP+DEX组小鼠5天生存率差异有统计学意义（P<0.05）。2.HE染色结果显示,CON组肝细胞形态正常,排列整齐,无水肿、细胞坏死;与CON组相比,CLP组肝细胞有明显病理改变,如炎性细胞浸润、肝细胞肿胀、排列紊乱;CLP+DEX组肝细胞病理改变较CLP组有所改善。3.肝损伤标志物检测结果:CLP组ALT、AST在6 h时显著升高,12 h时降低,24 h时显著升高;CLP+DEX组ALT、AST在6 h和24 h时显著低于CLP组（P<0.05）。两组在12 h没有显著差异。4.ELISA结果表明,CLP可诱导小鼠血清炎症细胞因子水平升高。脓毒症诱导6 h,与CLP+DEX组相比,CLP组TNF-α、IL-1β和IL-10水平显著升高（P<0.05）。脓毒症诱导12 h,CLP组TNF-α、IL-1β、IL-10水平下降,与DEX+CLP组无显著性差异。脓毒症诱导24 h,CLP组上述三种炎症因子水平均显著高于CLP+DEX组（P<0.05）。IL-6检测结果与上述炎症细胞因子的检测趋势不同。CLP组和CLP+DEX组IL-6在6～12 h时均升高,两组间无统计学差异。CLP+DEX组24 h时IL-6明显下降,CLP组仍处于高水平（P<0.05）。结论:初步证实DEX对CLP诱导的急性肝损伤具有保护作用,小鼠24 h存活率升高。在CLP建模后24 h,CLP+DEX组小鼠体内炎性细胞因子和肝损伤标志物的表达降低。第二部分右美托咪定对脓毒症小鼠肝损伤保护作用与体内自噬水平的相关性及机制探讨目的:观察DEX在脓毒症中的抗炎作用与自噬之间的关系,从自噬角度探讨DEX抑制脓毒症小鼠炎症反应,缓解肝组织损伤的分子机制。方法:脓毒症动物模型建立及分组处理同第一部分。小鼠分组为（i）CON组（假手术组）;（ii）CLP组（CLP诱导肝损伤+生理盐水）;（iii）CLP+DEX组（CLP诱导肝损伤+DEX）。透射电镜观察肝组织超微结构。免疫荧光法检测小鼠肝组织LC3II表达。蛋白免疫印迹法（Western blot）检测小鼠肝组织自噬相关蛋白LC3Ⅱ、Beclin-1、p62、LAMP-2、AMPK、p-AMPK、SIRT1蛋白表达。免疫组化法检测小鼠肝组织SIRT1表达。结果:1.透射电镜结果显示,CLP+DEX组在不同时间点均能清晰观察到自噬体结构。在CLP组中,在6 h和12 h在肝细胞中观察到典型的自噬体结构,24 h时间点没有发现明显的自噬体。2.Western Blot结果显示,CLP组小鼠肝组织中的LC3II和Beclin-1水平在CLP后6 h下降,在12 h达到峰值,然后在24 h下降。与CLP+DEX组相比,CLP组在6和24小时的LC3II和Beclin-1水平较低（P<0.05）,12 h未观察到显著差异。CLP后24 h各时间点,CLP组p62含量均显著高于CLP+DEX组（P<0.05）。各时间点CLP组与CLP+DEX组LAMP-2检测水平无差异。CLP组p-AMPK的水平在CLP后12 h升高,24 h下降。相比之下,CLP+DEX组的p-AMPK水平在1224 h显著升高,24 h CLP组与CLP+DEX组p-AMPK水平差异有统计意义（P<0.05）。与DEX组相比CLP+DEX组的SIRT1水平在24 h显著升高（P<0.05）。3.免疫荧光法半定量结果显示,CLP组12 h时LC3II阳性信号强,24 h阳性信号减弱;而CLP+DEX组在1224 h时阳性信号增强。CLP组与CLP+DEX组半定量结果在24 h差异具有统计学意义（P<0.05）。结论:CLP建模后24 h,DEX治疗的脓毒症小鼠肝组织自噬活性增强,AMPK/SIRT1水平上调,炎性细胞因子表达低。第三部分右美托咪定对LO2肝损伤细胞的保护作用及自噬流测定目的:探讨SIRT1在DEX诱导的自噬过程中的调控作用以及SIRT1被抑制后自噬流的强度变化。方法:体外实验使用D-GalN/LPS协同刺激建立L02原发性肝细胞损伤模型。1.为确定D-GalN/LPS协同刺激建立肝损伤模型的最适浓度,将细胞分为两组:（1）对照组（Control,CON）;（2）肝细胞损伤组（D-GalN/LPS）。建立D-GalN浓度梯度（0.1,1,10,50,100mM）与LPS（10 ng/mL）协同刺激进行CCK-8（Cell Counting Kit-8）细胞活力检测。2.为确定DEX对肝损伤模型的保护作用的最佳浓度,将L02细胞分为三组:（1）CON;（2）D-GalN/LPS;（3）右美托咪定治疗组（DEX+D-GalN/LPS）。DEX+D-GalN/LPS组根据DEX剂量不同划分为四个浓度梯度亚组（1,10,20,100μM）,每组与D-GalN（10 mM）/LPS（10 ng/mL）共同处理细胞。分别于处理后6 h,12 h,24 h,48 h进行CCK-8细胞活力检测并观察细胞形态学变化。3.将L02细胞分为六组:（1）CON;（2）D-GalN/LPS;（3）DEX+D-GalN/LPS（DEX分为1和10μM浓度亚组）（4）SIRT1抑制剂组（DEX+EX527+D-GalN/LPS,DEX分为1和10μM浓度亚组）。D-GalN浓度为10 mM,LPS浓度为10 ng/mL,EX527浓度为10μM。蛋白免疫印迹法（Western Blot）检测不同组别细胞SIRT1表达。4.L02细胞分为四组:（1）CON;（2）D-GalN/LPS;（3）DEX+D-GalN/LPS;（4）DEX+EX527+D-GalN/LPS。D-GalN浓度为10 mM,LPS浓度为10ng/mL,DEX浓度为1μM,EX527浓度为10μM。采用2’,7’-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）法测定细胞内ROS（Reactive oxygen species）水平。5.双标记腺病毒m RFP-GFP-LC3转染细胞,预实验确定腺病毒感染MOI条件。细胞分组、药物处理浓度同步骤（3）。细胞培养24 h、48 h后,利用荧光显微镜检测分析自噬体和溶酶体的形成情况观察自噬流。结果:1.在D-GalN/LPS的共同刺激下,与对照组相比,随着D-GalN的浓度升高L02细胞存活率逐渐下降,呈剂量依赖性。L02细胞在D-GalN浓度为10 mM时,与CON组和20 mM组细胞存活率比较均具有明显统计学意义（P<0.01）。20 mM,50 mM,100 mM三组细胞细胞活力显著下降,且三组间组间差异无统计学意义。选择浓度为D-GalN（10 mM）/LPS（10 ng/mL）为建立肝细胞损伤模型的条件,与DEX共同处理进行后续实验。2.结果显示,浓度为1,10,20μM的DEX对10 mM的D-GalN/LPS肝损伤细胞具有保护作用,1,10μM的DEX保护作用较好,在6,12,24,48 h四个时间节点与10 mM D-GalN/LPS组相比均具有统计学差异（P<0.05）。高浓度100μM的DEX对肝细胞保护作用不明显,与D-GalN/LPS组相比不具有统计学差异。故采用浓度为1,10μM的DEX进行后续实验。3.Western blotting显示EX527显著下调了DEX（1,10μM）和D-GalN/LPS共培养的L02细胞的SIRT1水平。4.与D-GalN/LPS组和DEX+EX527+D-GalN/LPS组相比,2448 h DEX+D-GalN/LPS组的ROS含量下降（P<0.05）。5.MOI=100时细胞荧光强度适中,生长状态较好,故选用该病毒浓度进行后续实验。共培养24 h后,D-GalN/LPS组黄色自噬体少,溶酶体形成较多;DEX+D-GalN/LPS组黄色自噬体的形成增多;DEX+EX527+D-GalN/LPS组L02红色自噬溶酶体形成较多。右美托咪定治疗组组分别与肝细胞损伤组和SIRT1抑制剂组相比,自噬体形成差异具有统计学意义（P<0.01）。48 h后,DEX+D-GalN/LPS组中红色自噬溶酶体增多,而D-GalN/LPS组和DEX+EX527+D-GalN/LPS组自噬体和溶酶体均较少。右美托咪定治疗组分别与肝细胞损伤组和SIRT1抑制剂组相比,溶酶体形成差异具有统计学意义（P<0.01）。结论:SIRT1抑制剂显著增加细胞内ROS水平并逆转DEX对自噬流的影响。